1. 原核基因组与真核基因组（prokaryotic genomes and eukaryotic genomes）
大小（size）：原核生物的一般都比较小，且变化范围也不大（最大/最小约为20）。 真核生物的一般要比原核生物的大很多，且变化范围也很大（最大/最小可达8万）
? 基因结构（gene structure: continuous coding sequences, split genes）
原核基因组：环状，较小；通常由单拷贝或低拷贝（low-copy）的DNA序列组成；基因排列紧密，较少非编码序列 —— ―streamlined‖
真核基因组：多线状；大小一般要比类核基因组大好几个数量级，且变化范围很大；有大量的非编码序列（重复序列、内含子等）
? 非编码序列（non-coding sequences: repeated sequences, introns）
局部分布的重复序列（localized repeated sequences）：串联式（tandem）的高度重复序列（highly repeated sequences）：重复单位的长度从几bp到几百bp，可重复几十万次或更多，常见于着丝粒、端粒和异染色质区域
散布的重复序列（dispersed repeated sequences）：
短的散布式重复序列（short interspersed elements, SINEs）：500 bp以下，可重复10^5次或更多，很多SINEs都是反转录转座子（retroposon）；长的散布式重复序列（long interspersed elements, LINEs）：5 kb以上，可重复10^4次或更多，很多LINEs也是与反转录转座子相关的序列
内含子（intron）：I 类（group I intron）、II 类（group II intron）、III 类（group III intron）、核mRNA内含子（nuclear mRNA intron），即剪接体内含子（spliceosomal intron）、核tRNA内含子（nuclear tRNA intron）、古细菌内含子（archaebacterial intron）
? 细胞器基因组（organelle genomes: mitochondrial genomes, chloroplast genomes） 线粒体基因组：在不同类型的生物中变化很大
多细胞动物：细小、致密，没有或很少非编码序列
高等植物：复杂、不均一，比动物的大得多
原生动物、藻类、真菌：或偏向于动物型，或偏向于植物型，但又有其各自的独特之处 叶绿体基因组：
比较均一，85 ~ 292 kb（大部分都在120 ~ 160 kb之内）
2. 转录（transcription）
（1）RNA聚合酶（RNA polymerase）
原核生物：1种，全酶（holoenzyme）由核心酶与?亚基组成，?亚基的作用
真核生物：3种，由多个亚基组成
cis- 顺式、同一分子 trans- 反式、不同分子
in vivo 体内、细胞内 in vitro 体外、无细胞体系
in situ 原位 in silico 基于生物信息学的研究体系
sense strand有义链）= nontemplate strand
antisense strand（反义链）= template strand
（2）顺式作用元件与反式作用因子（cis-acting elements and trans-acting factors） 启动子（promoters）、增强子（enhancers）为顺式作用元件
原核启动子：-10 box (Pribnow box), -35 box
真核启动子：I类， II类，III类
RNA聚合酶I识别的启动子（I类启动子，class I promoters）
RNA聚合酶II识别的启动子（II类启动子，class II promoters）
RNA聚合酶III识别的启动子（III类启动子，class III promoters）
增强子：较多在真核生物中存在；能增强转录的元件，但又不是启动子的一部分（无位置、
方向的限制），增强子常在启动子的上游，但也可以在基因内部（如内含子中）
转录因子（transcription factors）为反式作用因子，真核基因的转录需反式作用因子
通用转录因子能使聚合酶结合到启动子上，形成预起始复合物（preinitiation complex），包括形成开启的启动子复合物（open promoter complex），但只能导致基础水平的转录 通用转录因子： I类， II类，III类
II类因子：Polymerase II 转录所需的通用转录因子
II类预起始复合物:包含有RNA聚合酶II及6种通用转录因子：TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH。TFIID在TFIIA的协助下，首先结合到TATA box，形成DA复合物，然后TFIIB再结合上去。
TFIIF协助Polymerase II结合到DNA链上（-34至+17区域）
TFIIHE、TFIIH结合到复合物体中，形成DABPolFEH预起始复合物
TFIID的结构及功能：TFIID本身是一个复合物，含1个TATA box结合蛋白（TATA box-binding protein, TBP）和8 ~ 10个TBP相联因子（TBP-associated factors, TAFs, or TAFIIs）TATA box结合蛋白（TBP）：序列非常保守的一种蛋白质（约38 kD），包含180个氨基酸的羧基末端，该末端是TATA box结合域（binding domain）、TBP 是马鞍形的，结合到DNA双螺旋的小沟上，能使TATA box弯曲80°
TBP相联因子（TAFIIs ）：至少有8种，序列上也相当保守
主要功能：促进转录、与启动子的元件相互作用（起始子、下游元件）、与基因特异转录因子相互作用、TAFIIs中的TAFII250还有酶的功能，如作为组蛋白乙酰转移酶
TFIIA：在酵母中有2个亚基，在果蝇和人中有3个亚基；TFIIA可以看成是一种TAFII（与TBP结合，能稳定TFIID与启动子之间的结合）；在体外体系中，TFIIA并非必不可少 TFIIB：单亚基的因子（35 kD）；能把TFIID与TFIIF/Pol II相连在一起，即是聚合酶II结合到预起始复合物所必需的；能与一些基因特异转录因子相互作用，促进转录
TFIIF的结构及功能：由2条多肽构成：RAP30与RAP70（RAP stands for RNA polymerase II-associated protein）；RAP30与E. coli的?因子有一定的同源性，能使TFIIF结合到Pol II；FIIF与Pol II结合后，能减少聚合酶与DNA之间非特异的相互作用，引导聚合酶到已结合有TFIID、TFIIA和TFIIB的启动子上
TFIIE：有2个亚基（56 kD, 34 kD），每个亚基在TFIIE中都有2个拷贝（总分子量约为200 kD）；能结合到DABPolF的复合体上，对转录有促进作用
TFIIH：最后一个结合到预起始复合物的通用转录因子，结构、功能均复杂
功能之一是使Pol II最大一个亚基的羧基末端域（CTD）磷酸化，即使Pol IIA变为Pol IIO，从而导致转录起始到转录延伸过渡；具有DNA解螺旋酶（helicase）的活性，这是聚合酶离开启动子往前转录（promoter clearance）所需的
I类因子（class I factors）：Polymerase I 转录所需的通用转录因子
I类预起始复合物:RNA聚合酶I和2种通用转录因子（I类因子）：SL1、UBF（上游结合因子，upstream-binding factor）
SL1
由TBP（TATA box结合蛋白）与3种TAFs（TAFIs，TBP相联因子）组成的复杂蛋白质 SL1并不直接与启动子结合，但它能加强UBF与启动子的结合，促进预起始复合物的形成 SL1还是rRNA基因转录的物种特异性的决定因素之一
UBF
由2条多肽构成（97 kD和94 kD），而97 kD的多肽即具UBF的活性
能与I类启动子的核心元件及UCE（上游控制元件）的位点结合，再与SL1一起，促进转录
III类因子（class III factors）：Polymerase III 转录所需的通用转录因子，有TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC
TFIIIB和TFIIIC是所有在基因内部有III类启动子的基因的转录所需的，5S rRNA基因的转录还需要TFIIIA
TFIIIA
一类含―锌指‖（zinc finger）的DNA结合蛋白的成员；锌指是4个氨基酸与1个Zn离子结合，再加上其他的氨基酸，构成手指状；在TFIIIA中， 4个氨基酸是cys-cys-----his-his，一连9个锌指；锌指能使蛋白质与DNA紧密结合
TFIIIB和TFIIIC：两者是一起共同起作用的
TFIIIC结合到基因内部的启动子中（如果是5S rRNA基因，则先有TFIIIA结合到启动子区），再帮助TFIIIB结合到启动子上游区（转录起始位点上游），而TFIIIB则帮助Pol III结合在起始位点周围；转录开始后，TFIIIC（或TFIIIA和C）被除去，而TFIIIB留在原位，可促进另一轮的转录
具外部启动子的基因的转录因子
TFIIIB含有TBP（TATA box结合蛋白）及一些TAFIIIs，可结合到启动子的TATA box，从而促进转录，可能还需要其他一些通用转录因子
TBP在3类转录因子中的作用
与TATA box结合，组织预起始复合物（特别是对于没有TATA box 的启动子），促进转录 基因特异转录因子（激活子）
（1）基本结构：一般有2个功能域即DNA结合域（DNA-binding domain）和转录激活域（transcription-activating domain）；许多激活子还有二聚体化域（dimerization domain） DNA结合域的结构
锌指（zinc fingers）：不少激活子（如Sp1）都有该结构，锌指结构一般连续出现多次，由1个?-螺旋与1反向平行的?层片构成， ?-螺旋上的2个AA和?层片上的2个AA与1个Zn离子结合，―指‖上（?-螺旋上）的某些AA就决定了其与DNA结合的特异性
GAL4 蛋白质（the GAL4 protein）：酵母中的一种激活子，DNA结合域与锌指相似，但含有6个半胱氨酸和2个锌离子，有一个与DNA进行识别的区域（?-螺旋），决定其与DNA结合的特异性
核受体（the nuclear receptors）：与甾体激素相互作用，组成激素-受体复合物，起激活子的作用，核受体的DNA结合域含有2个锌离子，每一个锌离子分别与4个半胱氨酸结合，参与形成一指状结构，其中一―指‖（氨基末端的―指‖ ）上有专门用于识别DNA特异序列的?-螺旋
同源异形域（homeodomains）：在很多激活子中都存在，由基因中的同源异形框（homeobox）编码，而同源异形框一般是基因中的一个外显子，约180 nt，编码60AA，十分保守; 同源异形框最初在果蝇的发育调节基因中发现，这些基因的突变称为同源异形突变（homeotic mutation），会引起躯体结构的重大改变;含同源异形框的基因又称为同源异形基因（homeotic genes, homeobox-containing genes）
每个同源异形域含3个?-螺旋，第二、第三个形成一种―螺旋-转折-螺旋‖（helix-turn-helix）结构，而第三个螺旋起到识别DNA特异序列的作用;另外，同源异形域的氨基末端也插入到DNA的小沟中
bZIP和bHLH域：又称碱性域（the basic domain），能与DNA结合及形成二聚体；b表示碱性区；ZIP表示亮氨酸拉链（leucine zipper）；HLH表示―螺旋-环-螺旋‖（helix-loop-helix） bZIP：每个单体构成亮氨酸拉链的一半：在一条?-螺旋中，每7个AA就有1个leucine，因而leucine都在螺旋的一面；2个单体相互作用，就可构成一条―拉链‖；与DNA结合的部
分是―拉链‖下的碱性区，它们必须在bZIP形成二聚体后，才能与DNA特异识别、结合 bHLH：与DNA的复合体结构和bZIP-DNA复合体相似；helix-loop-helix为二聚体化域；较长的螺旋有碱性区，能与DNA特异结合
转录激活域似乎无特定且明显的结构，但可分3类：
酸性域（acidic domains）：富含酸性氨基酸，如酵母GAL4的激活域
富含谷氨酰胺域（glutamine-rich domains）：富含谷氨酰胺，如Sp1中的2个激活域 富含脯氨酸域（proline-rich domains）：富含脯氨酸，如CTF中的激活域
（2）激活子的功能
1、促进通用转录因子结合到启动子上（促进TFIID结合到启动子（预起始复合物）、促进TFIIB结合到预起始复合物、促进TFIIF/Pol II、TFIIE结合到预起始复合物）
2、促进RNA聚合酶II的全酶（holoenzyme）结合到启动子，形成完整的预起始复合物
3、至少在一些基因中，激活子通过促进整个全酶结合到启动子区域而激活转录
4、激活子是使增强子能远距离作用的原因
4种可能性（第三、四种可能性较符合实际情况）：Coiling (change in topology)、Sliding、Looping、Facilitated tracking (looping and tracking)
（3）多顺反子转录与单顺反子转录
多顺反子转录是原核生物的转录方式：操纵子（operons）Operon: A group of contiguous, coordinately controlled genes
经典模型：乳糖操纵子（the lac operon）有：lacZ: ?-半乳糖苷酶（ ?- galactosidase）基因、lacY: 半乳糖苷透过酶（galactoside permease）基因、lacA: 半乳糖苷乙酰基转移酶（ galactoside transacetylase）基因、lacI: 调节基因（regulatory gene）、Operator: 操纵区、Repressor: 阻遏子（阻遏物）、Inducer: 诱导物（异构乳糖，allolactose）
通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区，lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的，它们组成了一个操纵子（the lac operon）
阻遏的机制（两种假说）
聚合酶与阻遏物可一起结合在lac operon的启动子区，阻遏物的作用只是阻止转录从起始状态进入延伸状态
阻遏物的作用是不让RNA聚合酶进入lac operon的启动子（得到最新实验数据的支持） 阻遏物的调控是负调控（代谢物阻遏效应（catabolite repression））
乳糖操纵子的调控还需正调控因子
cAMP在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比，它与一种称为代谢物激活蛋白（catabolite activator protein，又称CAP）一起，起到正调控作用。CAP-cAMP的结合位点在启动子的上游（与启动子紧密相邻），该位点称为激活物位点。CAP-cAMP结合到激活物位点后，就会促进RNA聚合酶与DNA形成open promoter complex（ CAP-cAMP 能加快closed promoter complex的形成，从而提供了更多形成open promoter complex 的机会），结果是促进转录。 乳糖操纵子的正调控
乳糖操纵子的启动子实际上是一种弱启动子，其 -35 box与原核启动子相应的共同序列相差甚大，因此才需要CAP-cAMP进行正调控；如果是强启动子（与共同序列十分相近），则不需要正调控，但这种情况会使得即使葡萄糖存在，乳糖操纵子也一样运作。
弱化作用的调控：色氨酸操纵子（the trp operon）
合成代谢的操纵子，所编码的酶能把色氨酸前体分枝酸（chorismic acid）转化为色氨酸。色氨酸浓度高，则关闭；色氨酸浓度低，则开启；具弱化子（attenuator），无CAP-cAMP调控 色氨酸操纵子有5个结构基因（EDCBA）及1个调节基因（R）；启动子（trpP）与操纵区（trpO）在结构基因的上游，且操纵区完全在启动子里面；在调控中，色氨酸的作用是帮助
阻遏物结合到操纵区，从而使操纵子关闭
弱化作用（attenuation）
在阻遏作用的基础上（色氨酸操纵子的阻遏作用较弱），能再降低转录水平10 倍
前导区与弱化子转录物的第一种较稳定的结构有一终止子（?-independent terminator），能使弱化作用发生，转录终止
转录物的第二种较不稳定的结构没有终止子，转录能继续
色氨酸的多寡决定形成哪一种结构（在转录与翻译偶联的情况下）
在细菌中，当色氨酸操纵子的前导区转录后，翻译就开始
核糖体到达色氨酸密码子时，若色氨酸缺乏，核糖体不能前进，翻译受阻，前导区与弱化子转录物只能形成第二种结构；结构基因能转录；若色氨酸充足，前导肽的翻译能顺利完成，前导区与弱化子转录物能形成第一种较稳定的结构，导致弱化作用发生
调控能达成的必要条件
转录与翻译偶联，且速率大致相等
每个结构基因的转录产物都有其起始密码子，核糖体从各个基因的mRNA的起始信号（密码子）开始翻译，即结构基因的翻译与前导序列的翻译无关
细菌能符合这样的要求，说明其体系中各组分的协调性
单顺反子转录是真核生物的主要转录方式
（4）转录起始、延伸及终止
起始所需条件
原核生物：RNA聚合酶全酶，启动子
RNA聚合酶（RNA polymerase）：?（40 kD）、?（150 kD）， ??（160 kD）、?（70 kD）：specificity factor
核心酶（core enzyme）：?， ??，2 ?，全酶（holoenzyme）： ?， ??，2 ?，?
?: specificity factor
全酶（holoenzyme）由核心酶与?亚基组成
启动子（promoter）：聚合酶的结合位点（binding site），一般位于转录起始位点上游 Promoter structure
共同序列（consensus sequence）：Pribnow box (-10 box, David Pribnow发现)、-35 box（-10 box与-35 box的最佳距离为17 ? 1 bp）
下调突变（down mutation） 上调突变（up mutation）
强启动子还有一些额外的元件，如E. coli编码rRNA的rrn gene中的UP element（上游元件），可提高表达数十倍
转录起始（transcription initiation）Four steps:
Formation of a closed promoter complex
Conversion of the closed promoter complex to an open promoter complex
Polymerizing the first few nucleotides (up to 10) while the polymerase remain at the promoter Promoter clearance
真核生物：RNA聚合酶，启动子，转录因子，染色质的合适结构（启动子区无核小体） RNA聚合酶I （Polymerase I）： large rRNA precursor，位于核仁
RNA聚合酶II （Polymerase II）： mRNA precursors, snRNAs，位于核质
RNA聚合酶III（Polymerase III）：tRNA precursors, 5S rRNA precursor, U6, etc位于核质 Polymerase I、II、III都由多个亚基组成：均有两个较大的亚基（> 100 kD）、另有多个较小的亚基（大部分 < 50 kD），三种聚合酶都有一些共有亚基（common subunit）
RNA聚合酶II的结构：研究得比较清楚的一种，有12个亚基（Saccharomyces cerevisiae
中）即Rpb1、 Rpb2、 Rpb3、 Rpb4、 Rpb5、 Rpb6、 Rpb7、 Rpb8、 Rpb9、 Rpb10、 Rpb11、 Rpb12
核心亚基（core subunits）：Rpb1, Rpb2, Rpb3，对聚合酶的活性必不可少，分别与原核RNA聚合酶的?‘, ?和?亚基同源，且功能也基本相同（Rpb3在聚合酶中也是有2个拷贝） 核心亚基Rpb1的特殊之处-------不均一性（heterogeneity）：在细胞内，有210 kD和240 kD两种形式（IIa和IIo）；在体外，还有180 kD这种形式（IIb）
共有亚基（common subunits）：与Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, Rpb12相应的亚基，在3种 RNA聚合酶中都存在，在3种聚合酶中都存在，说明它们是起着十分重要的作用，但具体的功能不很清楚
非必需亚基（nonessential subunits）：Rpb4, Rpb9，其基因的突变体在正常温度下仍有活力，但在较高或较低温度下则失去活力；Rpb4和Rpb7（必需的亚基）与启动子的识别有关（有点像?因子）、Rpb9的功能不甚清楚
Rpb7和Rpb11：另类亚基（不属于上述3类）、RNA聚合酶的活性所需（Rpb7与启动子的识别有关）
RNA聚合酶II的全酶（the polymerase II holoenzyme）：RNA聚合酶II的所有亚基 + 部分通用转录因子 + 其他一些蛋白质因子
真核生物的启动子：
II类启动子：与原核基因的启动子最相似，可含有四类元件（TATA区（TATA box）、起始子（initiator）、下游元件（downstream element）、上游元件（upstream element）），前三类是核心启动子（core promoter）的元件
TATA区（the TATA box）：位于转录起始位点上游约25 bp（以中部计，在酵母中可达50 ~ 70 bp），共同序列为TATAAAA（in the nontemplate strand, similar to prokaryotic -10 box） 功能：确定转录起始位点（一般是TATA区的第一个核苷酸后30 bp）；有时甚至是决定整个启动子是否有作用
有些基因的TATA区序列与其共同序列相差较大，而只在某些类型的细胞中才表达的基因则有明显的TATA区
有些基因甚至没有TATA区（看家基因（housekeeping genes）、控制发育的基因）
起始子（initiator）：转录起始位点前后的保守序列，共同序列为：PyPyANT/APyPy（Py: pyrimidine、N: any nucleotide、）
有些基因仅有起始子序列作为其启动子
下游元件（downstream element）：某些基因的启动子中存在、位于转录起始位点下游，无共同序列
上游元件（upstream element）：在TATA区的上游：GC boxes：富含G和C，如GGGCGG（-47 ~ -61 region, in the coding strand）和CCGCCC（-80 ~ -105 region），可有2个或更多的拷贝、CCAAT box：共同序列为CCAAT
I类启动子：变化较II类启动子大，无甚保守序列（即随物种而异）；有一定的结构特征（核心元件（core element），转录必不可少、上游控制元件（upstream control element, UCE），高效转录所需，核心元件与上游控制元件之间的距离很重要）
III类启动子：位于基因内部（5S rRNA基因（+50 ~ +83）、tRNA基因）；位于基因外部，类似RNA聚合酶II识别的启动子（含TATA box）(U6 snRNA基因\7SL RNA基因\7SK RNA基因)
延伸
原核生物： RNA聚合酶核心酶
核心酶起极其重要的作用，?亚基参与转录出的RNA的磷酸二酯键的形成
转录的拓扑学：两种假说
RNA polymerase 及新合成的RNA都围绕DNA旋转
RNA polymerase前后的DNA反向旋转（有较多的依据：拓扑异构酶topoisomerase的存在） 真核生物：RNA聚合酶，延伸因子等
延伸因子：TFIIS，能促进转录延伸，阻止聚合酶在转录过程中较长时间的暂停；TFIIF，也有阻止聚合酶短暂停止的功能，
RNA聚合酶II的全酶：RNA聚合酶II所有亚基+部分通用转录因子+其他一些蛋白质因子 终止
原核生物：依赖于?因子的终止（?-dependent terminator (termination)）和不依赖于?因子的终止（intrinsic (?-independent) terminator ）
聚合酶到达终止子（terminator）就会从模板上脱落
?-independent termination：较为简单，一段反向重复序列（inverted repeat）与一富含T的区域（T-rich region in the nontemplate strand）即为终止信号
?-dependent termination：终止子只有一段反向重复序列（能形成hairpin结构）；?是一种蛋白质（6聚体），可使RNA聚合酶的转录能力大大下降（具RNA-DNA解螺旋酶的作用，能解开转录复合体中RNA-DNA双链）
真核生物：比较复杂，且不如原核生物清楚
polymerase I与polymerase III的转录终止与原核生物有一定的相似性
polymerase II的转录在聚腺苷酸化位点后至少几百bp才终止
染色质结构对真核基因转录的影响：
若启动子区上有核小体结构，则基因不转录；若没有核小体结构，则可转录
核小体结构只由核心组蛋白（H2A, H2B, H3, H4）与DNA构成时，即能起到抑制基因转录的作用，且一般的转录激活子不能解除这种抑制；若核小体结构还含有组蛋白H1，那么其抑制基因转录的能力更强，但H1的这种作用可被转录激活子抵消
核小体定位（nucleosome positioning）：转录激活子能使核小体结构不在启动子区内形成，而只在启动子周围形成；核小体定位使得启动子区成为无核小体区（nucleosome-free zones），对DNase高度敏感
组蛋白有2种形式：乙酰化、无乙酰化
组蛋白乙酰化（histone deacetylation）
乙酰化的形式是在赖氨酸侧链的氨基上加上乙酰基，组蛋白的乙酰化与否是与基因的活性有关的，乙酰化的组蛋白对转录的抑制作用较弱，因为它使染色质结构（核小体结构）发生变化，使组蛋白易从DNA上脱落；起乙酰化作用的酶是组蛋白乙酰基转移酶（histon acetyltransferase, HAT）；酵母中的组蛋白乙酰基转移酶还是一种转录激活子的辅助因子，其他一些转录激活子的辅助因子也是组蛋白乙酰基转移酶
细胞核中能促进转录的组蛋白乙酰基转移酶（HAT A）与细胞质中的（HAT B）是不同的 HAT A能结合到染色质上，使核小体中的核心组蛋白乙酰化
HAT B是使细胞质中新合成出来的H3和H4乙酰化，从而使它们能正确地组装到核小体中（它们的乙酰基在组装后就会被组蛋白去乙酰化酶除去）
组蛋白去乙酰化（histone deacetylation）能抑制转录，由组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases）催化，组蛋白去乙酰化酶要与其他转录抑制因子相互作用，才能在合适的区域使组蛋白去乙酰化
必须对染色质进行“改造”，才能除去核小体，使基因可转录
染色质改造需要2类蛋白质：Swi/Snf (pronounced ―switch-sniff‖)和ISwi (initiation switch) Swi/Snf能改变核小体核心的结构，ISwi能移走核小体
核小体与转录延伸
聚合酶前进时，能把遇到的核小体移动位置，因而转录后，所有核小体的位置都发生了改变；且在转录后，核小体一般是被后移了（移到聚合酶后）
3. 转录后的加工
（1）剪接（splicing）
核mRNA前体的剪接（剪接体）：Step 1：内含子内的一个腺苷酸的2‘ 羟基进攻连接内含子 5‘ 端与外显子的磷酸二酯键，产生一个游离的外显子（5‘ 外显子）与一个套环（lariat）结构（内含子 + 3‘ 端外显子）的中间产物；Step 2： 5‘ 端外显子的 3‘ 羟基进攻连接内含子3‘ 端与外显子的磷酸二酯键，使两外显子连接起来，并产生套环状的内含子
剪接信号：剪接信号发生变化，则剪接就会受到影响（改变）
高等真核生物：5‘-AG/GUAAGU——YNCURAC—YnNAG/G- 3‘
Y：嘧啶（U or C）Yn：约由9个嘧啶组成 R：嘌呤（A or G） 酵母：5’-AG/GUAUGU——UACUAAC—YAG/G(UU)- 3’
剪接体（spliceosomes）：核mRNA前体、snRNAs (snuRNAs)与蛋白质的复合体，能进行核mRNA前体的剪接；snRNAs (snuRNAs): small nuclear RNAs，即核小分子RNA，有U1, U2, U4, U5, U6；snRNAs是用于识别剪接信号的，它们与蛋白质一起，组成核小分子核糖核蛋白（small nuclear ribonuclear proteins, snRNPs）；与snRNAs相应，有U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP, U5 snRNP, U6 snRNP
U1 snRNP：能与 5‘ 剪接位点的保守序列配对，这种配对（结合）是剪接所必需的，但光有配对还不足以促成剪接
U6 snRNP：能与内含子的5‘ 端配对，在剪接过程中还与U2配对，这些结合都是剪接所必需的
U2 snRNP：能与分枝位点周围的序列配对，且能与U6相互作用（通过碱基配对），对确定分枝位点及剪接都是必不可少的
U5 snRNP：能与 5‘ 端外显子的最后一个核苷酸和 3‘ 端外显子的第一个核苷酸结合，即能通过分子间相互作用把相邻的两个外显子靠在一起，是剪接的第二步所必需的
U4 snRNP：能与U6的部分序列配对，从而与U6结合在一起，使U6处于不活动状态；当U6需要发挥作用时，U4便与U6分离，使U6能参与剪接过程
实际上，剪接除了需要U1，U2，U4，U5，U6这几种snRNPs外，还需要一些称为剪接因子的蛋白质
选择性剪接（alternative splicing）：非特异的、默认的、唯一的剪接方式是组成型剪接（constitutive splicing）；一个基因转录出来的RNA前体，通过不同的剪接方式（选择不同的外显子）而形成不同的成熟mRNA，产生不同的蛋白质
选择性剪接往往与发育时期、细胞类型等有关，在20个真核mRNA前体中，约有1个可进行选择性剪接，在人类中，选择性剪接的比例更高，选择性剪接最初在小鼠免疫球蛋白 ?重链基因中发现，该基因通过选择性剪接，可产生分泌形式（?s）与膜结合形式（?m）的2种蛋白质
通过选择性剪接，可对基因的表达起一定的调控作用，因此选择性剪接常用于在不同的组织或发育时期产生组织特异或调控发育的蛋白质
选择性剪接还可有重要的生物学效应，如在果蝇的性决定体系中起重要的作用
? 自剪接的内含子（self-splicing introns）
最初由Thomas Cech等人在四膜虫(Tetrahymena) 的26S rRNA基因中发现；该基因转录的rRNA前体有1个内含子，而其剪接不需要剪接体，也不需要任何蛋白质的帮助，因此是一种自剪接；自剪接的内含子在核rRNA基因、细胞器基因和原核基因中都存在
I 类内含子（Group I introns）：一般都是核rRNA基因的内含子（主要在纤毛虫中），还有一些是线粒体基因、叶绿体基因及细菌基因的内含子，在体内也进行自剪接
I 类内含子的剪接机制：Step 1：外源鸟苷酸（GTP）的羟基进攻内含子 5‘端的A（连结UA的磷酸二酯键），释放出5‘外显子（外显子1），并形成一中间产物 Step 2：5‘外显子3‘端的羟基进攻3‘外显子（外显子2）5‘端的磷酸二酯键，使5‘外显子与3‘外显子连结起来，并释放出内含子
II 类内含子（Group II introns）：主要存于线粒体基因、叶绿体基因及细菌基因中，在体外条件下可自剪接，在体内往往有蛋白质参与剪接；剪接机制与核mRNA内含子的有很大的相似性（形成套环中间产物等）
总体上，剪接过程与剪接体的很相似：内含子本身的序列代替了U1、U2、U4、U5、U6 实际上，核mRNA内含子（包括参与剪接的snRNA）与II 类内含子是有进化关系的
? 核tRNA内含子的剪接
核tRNA内含子：内含子较小（10 bp左右），且只有1个，一般在相应于反密码子的碱基附近（与反密码子的 3‘端隔1个核苷酸）
tRNA剪接（tRNA splicing）：分2步进行，需要tRNA内切酶及RNA连接酶的参与 Step 1：由剪接内切酶把内含子切除Step 2：由RNA连接酶把两个外显子连接起来
（2） 加帽与聚腺苷酸化（capping and polyadenylation）：真核生物mRNA特有 加帽（capping）:
帽子结构：含7-甲基鸟苷（m7G），主要有3种形式
第一种（Cap 0）：只在一些病毒mRNA中存在，无2‘-O-甲基核苷酸
第二种（Cap 1）：在真核细胞及病毒mRNA中存在，有1个2‘-O-甲基核苷酸
第三种（Cap 2）：只在真核细胞中存在，有连续2个2‘-O-甲基核苷酸
帽子的合成：需要3种酶；核苷酸磷酸水解酶（nucleotide phosphohydrolase；又称RNA三磷酸酯酶，RNA triphosphatase）；鸟苷酸转移酶（guanylyl transferase）；甲基转移酶（methyl transferase）
加上帽子的时间：在一些病毒中，转录起始后就马上加帽；有些病毒的转录与加帽并不偶联；在真核细胞中，加帽在转录早期进行（在RNA前体的长度达到30个核苷酸之前）
帽子的功能：保护mRNA：一般的RNase不能切割含有3个磷酸基的帽子；提高翻译能力（效率）：通过与帽子结合蛋白结合，mRNA能更好地进入核糖体；有利于mRNA在细胞内的运输（运出细胞核）：若没有帽子，则mRNA基本上留在细胞核；使mRNA前体的能正确剪接：第一个内含子的剪接所需
帽子对剪接的影响：缺乏帽子会抑制第一个内含子的剪接，无甲基化的帽子（Gppp）对第一个内含子的剪接也有负效应
原因是由于帽子结合复合体（cap-binding complex, CBC）的作用；CBC由2种帽子结合蛋白（cap-binding proteins, CBPs）组成，若没有帽子或只有无甲基化帽子，则mRNA不能与CBPs结合，导致第一个内含子的剪接难以进行（剪接体难以形成）
聚腺苷酸化（polyadenylation）：在mRNA（前体）3‘端加上poly(A)；poly(A)的长度：平均为250 nt；由poly(A)聚合酶 [poly(A) polymerase, PAP] 把AMP残基逐个地加到mRNA前体的3‘端；一般都是在剪接前发生
poly(A)的功能：保护mRNA：延长其寿命（半衰期）；提高mRNA的翻译能力：能与poly(A)结合蛋白 [poly(A) binding protein I] 结合，促进翻译，促进mRNA与核糖体结合
poly(A)对剪接的影响：poly(A)能促进最后一个内含子（与poly(A)最接近的内含子）的剪接，而对其他内含子的剪接无甚影响
（3）rRNA与tRNA前体的加工（rRNA and tRNA processing）
rRNA的加工：
真核生物rRNA前体的加工：转录单位转录出来的rRNA前体，要在核仁中进行加工，参与加工的有内切酶、外切酶、核仁小分子RNA（snoRNA）等
原核生物rRNA前体的加工：与真核生物rRNA前体的加工有一定的相似性，不过原核rRNA基因一般以操纵子的形式存在，且整个基因组只有几套（E. coli有7套），参与加工的有RNase III、 RNase E等
tRNA的加工
真核生物： tRNA前体含单个tRNA分子，两端有额外的序列，其加工是要除去这些额外的序列
原核生物：tRNA前体含1至多个tRNA分子，或与rRNA前体混在一起，故加工首先要把含单个tRNA分子的片段切割出来（由RNase III负责），然后再除去5‘及3‘ 端额外的序列 真核生物与原核生物tRNA 5’ 端的加工成熟
由RNase P负责，一次切割即除去5‘端的额外的序列
RNase P含有2个亚基，一个是RNA（M1 RNA，125 kD），另一个是蛋白质（14 kD），而起催化（酶切）作用的是RNA这个亚基
有6种RNase参与：RNase D、RNase BN 、RNase T、RNase PH、RNase II、PNPase (polynucleotide phosphorylase, 多核苷酸磷酸化酶)；其中PNPase、 RNase PH 和 RNase T最为重要
（4）反式剪接（trans-splicing）
顺式剪接：所有参与剪接的外显子都在同一个基因中（同一个RNA分子中）
反式剪接：参与剪接的外显子并不在同一个基因中（即在不同的RNA分子中）；反式剪接只在某些生物中发现
锥虫中的成熟mRNA
在锥虫中，成熟mRNA的5‘端都有一段35 nt的序列（前导序列，spliced leader, SL），而这一序列在相应的mRNA基因中是不存在的；该前导序列是由另一个基因编码——编码前导序列加上含有 5‘端剪接信号（相当于内含子 5‘端）的一段序列
解释锥虫中把前导序列连接到各个mRNA 5’端的2种假说
前导序列转录后作为引物用于其他mRNA基因的转录，形成连在一起的前体，然后剪接 前导序列与其他mRNA分别转录，然后再通过反式剪接连在一起
实际上是通过反式剪接把前导序列连接到各个mRNA的5’端（有Y形中间产物的存在）
（5）RNA编辑（RNA editing）
RNA编辑的发现：最初在锥虫的动基体（kinetoplast，即其线粒体）中发现
动基体DNA是由25 ~ 50个相同的大环（maxicircle，20 ~ 40 kb）和约10,000个小环（minicircle，1 ~3 kb）组成的网状结构；大环含有线粒体基因，而小环对线粒体基因的表达有作用
编辑的机制
在转录后进行，沿3‘ 5‘方向进行，由gRNA（guide RNA，向导RNA）指导进行 一些gRNA由大环的某些区域编码，另一些gRNA由小环编码
大部分gRNA < 80 nt
参与编辑的酶：核酸内切酶、3‘ 外切酶、末端尿苷酰转移酶（terminal uridylyl transferase, TUTase）、RNA连接酶等
（6）转录后的基因沉默（RNA干涉）Posttranscriptional gene silencing (RNA interference) 双链RNA（dsRNA）与RNA干涉
dsRNA导致相应的mRNA降解，从而使RNA干涉发生；RNA干涉需要ATP
RNA干涉的生物学意义：抑制RNA病毒的复制，抑制转座
RNA干涉的应用：研究基因表达的调控，研究基因的功能（可代替基因剔除）
4. 翻译
（1）起始（initiation：原核生物模型：核糖体大小亚基解离---—30S起始复合物的形成------fMet-tRNA与30S起始复合物结合--------30S起始复合物加上核糖体大亚基（50S）70S起始复合物
核糖体解离需要起始因子（initiation factors，IF）的协助
30S起始复合物由核糖体小亚基（30S）、mRNA、氨酰tRNA及起始因子等构成
mRNA与核糖体小亚基的结合：在起始密码子的上游（数个核苷酸），有一共同序列AGGAGGU，与16S rRNA 3‘端的序列（3‘ HO-AUUCCUCCAC 5‘）互补配对，是核糖体的结合位点；这一序列又称SD序列（Shine-Dalgarno sequence）；mRNA与核糖体小亚基的结合还需要有起始因子的协助：IF-3最重要，IF-1和IF-2也起一定的作用
甲酰甲硫氨酰tRNA（fMet-tRNA ）与30S起始复合物的结合主要由IF-2负责，IF-1和IF-3辅助，此外还需要GTP（GTP的作用是使IF-2能顺利地结合到核糖体小亚基上） 70S起始复合物的形成过程中IF-1和IF-3先从复合物中解离，接着IF-2解离，同时GTP水解成GDP和磷酸（促进IF-2解离），IF-2的解离是形成具活性的70S复合物所必需的
tRNA装载(tRNA charging)：在氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）的作用下，使氨基酸连接到tRNA 3‘端的腺苷酸上，形成氨酰tRNA（aminoacyl-tRNA）；氨酰tRNA合成酶的专一性很高，共有20种，每一种只用于单一种氨基酸与相应tRNA的结合
tRNA识别（第二遗传密码）：tRNA上的某些结构特征能使它在氨酰tRNA合成酶的催化下，与特定的氨基酸结合；这些结构特征就是―第二遗传密码‖（the second genetic code）；―第二遗传密码‖常在tRNA的受体茎（acceptor stem）上，但在其他区域的也有不少；―第二遗传密码‖较复杂，且是非简并的，但专一性同样很强
起始tRNA：携带甲酰甲硫氨酸的tRNA（tRNAfMet），识别密码子AUG、GUG和UUG
MettRNAMettRNA与携带甲硫氨酸到蛋白质链内部的tRNA（）稍有不同，后者只识别AUGfm
真核生物的翻译起始与原核生物的翻译起始的差异：
起始氨基酸不是甲酰甲硫氨酸，而是甲硫氨酸；起始tRNA则为tRNAiMet
真核mRNA不含SD序列，但有5‘帽子，有助于起始复合体的形成
通过扫描寻找起始密码子
扫描（scanning）：在大多数情况下，扫描遇到的第一个AUG就是翻译的起始位点；在其周围，往往有共同序列CCRCCAUGG
在5 ~ 10%的情况下，第一个AUG并不是起始位点，因为其周围的序列不太合适；在这种情况下，扫描继续进行，直到找到合适的起始位点
有时，第一个或上游的AUG周围也有作为起始位点的合适序列，可进行翻译起始，但还不是真正的起始位点，因为该AUG后很快就有一终止密码子；因此翻译终止后，扫描又继续进行，直到找到下游的起始位点
起始因子（eIF：eukaryotic initiation factors）：要比原核生物的复杂，但也有相应的因子；主要的起始因子有6种（类）即eIF1、 eIF2、 eIF3、 eIF4、 eIF5、 eIF6
mRNA二级结构与翻译起始的关系：mRNA 5‘端附近的二级结构对翻译起始既可有正效应，也可有负效应；紧接AUG后（AUG后12 ~ 15 nt）的发夹结构能使核糖体停顿，因而使该AUG更有可能成为起始位点（即使其周围的序列与起始位点的共同序列相差较大）
原核生物的起始控制：mRNA二级结构对翻译起始的影响；反馈抑制（feedback repression） 真核生物的起始控制：最常见的起始控制是对起始因子磷酸化，起始因子的磷酸化在一些情况下对翻译起始起抑制作用，而在另一些情况下，却可起到促进作用
（2）延伸（elongation）：在原核生物与真核生物中基本相似，需延伸因子及肽基转移酶（peptidyl transferase）
（1）基本过程：Step 1：一个新的氨酰tRNA结合到核糖体的A位；Step 2：形成肽键；Step 3：移位（translocation）
step 1：需延伸因子（elongation factor）EF-Tu及GTP，另还需EF-Ts（在真核生物中由eEF1?和eEF1??分别起到EF-Tu和EF-Ts的作用）；校对（proofreading）如错误的氨酰tRNA进入了A位（反密码子与密码子不能很好配对），可进行校正
step 2：通过肽基转移酶（peptidyl transferase），把P位的肽链（或起始氨基酸）与A位的氨酰tRNA中的氨基酸以肽键连结起来，肽基转移酶是核糖体的组成部分，核糖体大亚基中的23S（真核生物中为28S）rRNA在催化肽键形成中起主要作用，具肽基转移酶活性 step 3：mRNA与肽基tRNA（peptidyl-tRNA）移动1个密码子的距离，使肽基tRNA进入P位，而原在P位的tRNA离开核糖体；移位需EF-G及GTP （在真核生物中由eEF2起到EF-G的作用）
（3） 终止（termination）：在原核生物与真核生物中基本相似，需释放因子
终止的过程：翻译到达终止密码子后，释放因子及GTP结合到核糖体的相应位点，促使肽链与tRNA的连结断开；接着释放因子和tRNA从核糖体解离（这一过程需GTP水解）；最后，核糖体与mRNA解离，核糖体大小亚基解离
终止密码子（termination codon）：UAG：琥珀密码子（amber codon）、UAA：赭石密码子（ochre codon）、UGA：乳白密码子（opal codon）
过早终止突变：琥珀型突变（amber mutation）：在编码区经突变产生了琥珀密码子，使蛋白质翻译过早终止、赭石型突变（ochre mutation）、乳白型突变（opal mutation）
终止密码子抑制（stop codon suppression）：琥珀型抑制（amber suppression），琥珀型抑制物（amber suppressor）、赭石型抑制（ochre suppression），赭石型抑制物（ochre suppressor）、乳白型抑制（opal suppression），乳白型抑制物（opal suppressor）
在原核生物中，释放因子有RF-1：能识别终止密码子UAA和UAG、RF-2：能识别终止密码子UAA和UGA、RF-3：一种依赖于核糖体的GTPase， RF-3先与GTP结合，然后能促进RF-1和RF-2与核糖体结合
在真核生物中，释放因子有eRF1能识别3种终止密码子、eRF3是一种依赖于核糖体的GTPase，能促进eRF1的作用
（4）G蛋白（G proteins）在翻译中的作用
IF-2、EF-Tu、EF-G、RF3等因子都需要与GTP结合，并通过GTP水解而发挥作用；它们是G蛋白（G proteins），具有内在的GTPase活性
5. 蛋白质前体的加工
（1）N末端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核）的切除
（2）二硫键的形成
（3）修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化等
（4）切除新生肽中非功能所需的片段
（5）蛋白质剪接：除去蛋白质内含子（intein）
5. 重组与转座
（1）重组的类型
同源重组（homologous recombination）
（1）同源重组的形式
常发生在同源染色体之间（分子间重组），也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）
（2）Holliday 模型
说明同源重组的一个经典模型，基于重组过程中有十字形的中间产物
（3）RecBCD重组途径
存于E. coli中，需要RecBCD蛋白（recB、recC、recD基因的产物）的参与
RecA：38 kD 的蛋白质，具多种功能，其中一种就是在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是一单链与一双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP
RecBCD：一种具多功能的酶
依赖于DNA的ATPase（水解ATP，为DNA的解螺旋提供能量）
DNA nuclease，可作用于单链或双链DNA，切割χ位点（GCTGGTGG）
χ (chi): crossover hotspot instigator
DNA helicase活性
RecBCD的切点与底物（序列）有关，可在χ位点3‘端4 ~ 6 nt
RuvA和RuvB：两者均具DNA helicase活性（RuvB还有ATPase活性），且两者一起才能与DNA很好地结合（RuvA先结合，然后RuvB才能结合）
它们专门与Holliday junction这样一种结构结合，促使branch migration发生
RuvA和RuvB与Holliday junction的结合位置十分特异
RuvC：解开Holliday junction所需的一种核酸酶，能特异地与Holliday junction结合，并在特异位点切开Holliday junction
RuvC是二聚体，有2个活性位点，因此能切开Holliday junction中的两条链
切割位点必须有特异的序列，因此，必须通过branch migration到达特异序列后， RuvC才能起作用（Holliday junction两种解开方式的相对多寡取决于两对同源单链上所具有的RuvC切割位点的相对多寡）
（4）减数分裂重组（meiotic recombination）
真核生物中常见的重组，与细菌中的重组有不少相似之处，但在起始的步骤有较大的差异（有DNA双链断裂，double-stranded DNA break）
（5）基因转换（gene conversion）多见于真核生物
当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列
基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，然后进行修复，就会使某一序列的比例增加
位点专一重组（site-specific recombination）
（1）?噬菌体的整合与切除
?噬菌体整合到宿主基因组需整合酶（Int，?的int基因编码）及宿主蛋白IHF，并通过同源区域attP（?）与attB（宿主）的重组而达成；?噬菌体从宿主基因组切除需整合酶（Int）、Xis（?的xis基因编码）及IHF，是整合的逆过程
附着（整合）位点（att sites）
attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15 bp，称为O）；attP的必需序列从–152到+82（以O的中点为0），而attB只需25 bp左右的序列（包括中间的O）
转座（transposition）
细菌的转座子
插入序列（insertion sequences，IS）
最简单的转座子，只含有转座所必需的元件：两端有反向重复序列（inverted repeats, 15 ~ 25
bp），中间有编码转座所需的酶的基因（至少有2个，编码转座酶，即transposase） 插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复（direct repeats）
带有抗性基因的转座子
除了必要的转座元件外，还含有抗生素抗性基因，能赋予其携带者某种抗性
转座的机制
复制性转座（replicative transposition）
转座过程有DNA复制，结果一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点
保守性转座（conservative transposition）
转座子离开原位置，插入到新的位点；这种转座又称非复制性转座（nonreplicative transposition ）
真核生物的转座子
玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator）:最早发现（1940s）的转座子，与某些品种的玉米种子上的色斑变化有关（玉米种子的颜色由C基因编码的因子造成；若C基因突变，就没有色素产生，种子几乎白色；若部分细胞产生回复突变，就会在种子上形成颜色斑点） Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座；Ac 或Ds插入到功能基因中，就会使该基因失活
Ds和Ac结构
Ac与细菌的转座子相似，约4500 bp，两端有反向重复序列，中部含有转座酶基因 Ds是Ac的衍生物（功能不全，不能自主转座），有Ds-a、Ds-b、Ds-c 3种
反转录转座子（retrotransposons）
以RNA作为中介进行复制（转座），与反转录病毒（retroviruses）的复制相似，含有编码反转录酶的基因，能进行反转录；酵母中的Ty（transposon yeast）、果蝇中的copia等反转录转座子的两端有LTRs（long terminal repeats）
6．基因组学：把基因组作为研究对象的学科
结构基因组学（structural genomics）其成就促进了生物信息学bioinformatics）的发展 基因组结构（genome structure）：种类、结构特点、种属特异性
定位基因（gene mapping）：遗传图谱（genetic map）与物理图谱（physical map）：遗传距离与物理距离
测定基因组全序列（whole-genome sequencing）：结构基因组学研究的主要目标；人类基因组计划（the Human Genome Project）之前，只测定过一些病毒（?X174、?、T4等）的基因组全序列
功能基因组学（functional genomics）：大规模、高通量分析基因组中基因表达的技术，如：DNA微阵列（DNA microarray）， DNA芯片（DNA chip）
基因功能的分析，如基因剔除（gene knockout），RNAi
对基因组中基因本身的认识（基因的概念）
编码蛋白质的基因 ?
编码功能RNA的基因 ?
非编码的DNA也可以是基因 ？
进化基因组学（evolutionary genomics）：在整体水平上研究基因和基因组的结构、功能的起源与进化
内容：基因和基因组如何通过并非很多的基本结构单位（构件）重组而进化成新的基因和基因组（构件在进化中被反复使用）；最原始的基因和基因组的起源，其后的进化模式与过程 比较基因组学（comparative genomics）—— 进化基因组学的初始阶段
通过比较，发现基因组中蛋白质和功能RNA基因的密度与生物的复杂程度有一定的负相关