授课教师常祖明 学生人数 55
课 题 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
授课类型新授课 授课方法讲授、演示
教学用具多媒体、实验室设备
教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学会琼脂糖凝胶电泳的操作技术
教学重点琼脂糖凝胶的制备及点样操作
教学难点理解琼脂糖凝胶电泳的原理
教学过程
一、实验目的
1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理
2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法
二、实验原理
1.DNA琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
（1）电荷效应
DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。
【等电点】
在某一pH的溶液中，DNA分子解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该DNA分子的等电点，用pI表示。
当DNA溶液pH＞ pI，-
当DNA溶液pH＜ pI，+
当DNA溶液pH=pI。溶解度最小。
（2）分子筛效益
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比，所以不同相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。
2.溴化乙锭对DNA分子进行染色的原理
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。
三、实验器材
1.电泳仪
北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN型
2.移液枪：5µl
3.微波炉
4.锥形瓶：250ml
5.线手套
6.容量瓶：1000ml
7.紫外分析仪
四、实验材料与药品
实验材料：实验五中鸡血DNA PCR产物
1.DNA Marker
作用：主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。
商品信息：2000bp，50次，紫色液体
理化性质：DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要成分Tris-HCl、EDTA、甘油、溴酚蓝
储存：短期4℃保存，长期-20℃保存。
危害：避免与皮肤眼睛接触。
2. GoldView核酸染色剂
作用：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView?即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。
商品信息：1ml/瓶
理化性质：
储存：室温保存2年。
危害：虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。
【使用方法】
1. 将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。
2. 加入5µl GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3. 冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。
4. 电泳完毕在紫外灯下观察。
【注意事项】
1. 胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。
2. 加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。
3.琼脂糖
作用：制备琼脂糖凝胶原料，分离和鉴定核酸。
商品信息：100g/瓶
理化性质：琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。
储存：阴凉干燥处密闭储存。
危害：无
4.三羟甲基氨基甲烷（Tris）
作用：生物缓冲剂，用于凝胶电泳配置缓冲液。
商品信息：500g/瓶
理化性质：是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。
储存：有吸湿性，在阴凉干燥处密闭储存。
危害：对眼睛、皮肤、呼吸道有刺激作用。
5.硼酸
作用：TBE缓冲液成分之一。
商品信息：分析纯，500g/瓶
理化性质：为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶，有滑腻手感，无臭味。溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中，水溶液呈弱酸性。
储存：阴凉干燥处密闭储存。
危害：有刺激性。
6.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）
作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
商品信息：瓶/250g。
理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。
储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。
危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。
7. 6×DNA LodingBuffer
作用：第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TBE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。
商品信息：5ml/瓶。含溴酚兰、二甲苯青和甘油等，按5ul样品加1ul Buffer，混匀直接上样。
理化性质：
储存：2-8℃两年。
危害：有刺激性。
五、实验试剂
1. 0.5×TBE（PH8.0）缓冲液
【5×TBE缓冲液（PH8.0）】母液
{Tris 108g + 硼酸27.5g + 0.5M EDTA 20ml} ® 定容到1000ml ® 高压灭菌 ® 4℃保存
临用时用水稀释10倍 ® 0.5×TBE缓冲液（PH8.0）
【0.5M EDTA（PH8.0）溶液】
水800ml + EDTA-2Na 186.1g ® 剧烈搅拌 ® 用NaOH调pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒） ® 定容至1L® 分装后高压灭菌备用。注意：EDTA-2Na 在PH值接近8.0时才能完全溶解。
2.1.0%琼脂糖溶液
琼脂糖0.5g + 0.5×TBE缓冲液50ml ® 放入锥形瓶中混匀 ® 微波炉中加热溶解
六、实验步骤
（一）1%琼脂糖凝胶的制备
1.选择合适的凝胶托盘放置于制胶器的合适区域。
2.称取1g琼脂糖置于250ml锥形瓶中，加入100ml 0.5×TBE缓冲液。
3.将锥形瓶放入微波炉中加热使琼脂糖充分溶解。
4.将5µl GoldView核酸染色剂加入其中，摇晃充分混匀。
5.待胶冷却至60度左右，将融化的琼脂糖小心的倒入制胶器中，速度要快，再把梳子（试样格）插入凝胶托盘两边槽内。
6.让胶自然冷却至完全凝固（约需20-30分钟）。小心的将梳子拔出（注意先拔一侧），将胶连同凝胶托盘放入电泳仪中，加入0.5×TBE缓冲液，使缓冲液没过凝胶1-2mm（注意加样孔靠近负极一端）。如样品孔内有气泡，应除去。
（二）加样
1.将适量的DNA Marker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。
2.在PCR产物中加入6×DNA LodingBuffer（每5ul产物加入1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加2ul。
3.盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，注意不要接错正负极。
4.调好电压，打开电源开始电泳，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。
（三）凝胶紫外观察：
凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。
七、注意事项
1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。
2.制胶和加样过程中要防治气泡的产生。
3.必须戴手套操作，严格注意防护。
4.加样时，Tip 头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。
5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。
6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。将两者混匀后加入点样孔，注意枪头尽量往下，同时防止气泡产生。
八、思考题
影响DNA迁移速率的因素有哪些？
第二篇：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)
t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义
一、 实验目的
1、掌握PCR反应的原理和方法；
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理
PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。
变性（denaturation）：双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。
退火（annealing）：引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。
延伸（extension）：在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，DNA链的延伸方向为5’-3’。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下，DNA呈现橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg或更少的DNA即可检出。
三、实验仪器
超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。
四、实验药品
蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH2O、EB、EDTA、SDS、引物。
五、实验内容
本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。
1、设计PCR反应系统
根据 PCR反应系统的组成和要求，设计 20μL或 50μL的反应体系，可以下表1提供的
50μL的PCR反应体系为参考。
表 1 PCR反应体系
2、进行PCR反应
PCR反应过程学生自行设计，可参考下列提供的PCR反应条件：94℃，5 min（热启动）；94℃，1min（变性）；52℃，1min（退火）72℃1.5min（延伸）；循环30次；72℃，10min；保温湿度；4℃。
3、对PCR反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定
将PCR反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：
1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的1×TAE或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。
2）溶液冷至60℃时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/mL（也可以在电泳之后再进行染色。）。
3）琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。
4）室温下放置30-45min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。
5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。
6）在DNA样品中加入1／6的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。
7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择l～5V／cm。
8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加EB的凝胶需要在含有 EB的缓冲液中浸泡约 20～25min。
9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。
t-PA是组织型纤溶酶原激活剂，由527个氨基酸组成。t-PA cDNA大小约1．6kb。
六、实验结果的讨论
1、PCR反应的原理是什么？影响PCR反应的主要因素是什么？
2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？如何选择琼脂糖凝胶的浓度？EB的作用是什么？