实验3转基因植物PCR检测

三、植物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

二、原理

DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带来分析DNA的完整性和浓度。因为EB作为一种荧光染料，能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNAMarker作为DNA分子量及浓度的参考，样品DNA的荧光强度就可以大致表示DNA量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA样品的完整性来进行，缺点是不太准确。

三、实验样品

提取的甘薯基因组DNA。

四、试剂

4.1 溴酚蓝指示剂点样缓冲液：0.2% 溴酚蓝和50% 蔗糖

4.2 1mg/ml溴化乙锭溶液

4.3 电泳缓冲液（TAE）：40 mmol/L Tris-乙酸和1 mol/L EDTA。24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml。

4.4 1.0% 琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50克，加入50ml TAE电泳缓冲液。

五、仪器

5.1 离心管；

5.2 微量移液器；

5.3 吸头；

5.4 电泳仪；

5.5 电泳槽；

5.6 透射紫外观察仪

六、实验步骤

6.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳

6.1 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。

6.2 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。

6.3 制备1.0%琼脂糖凝胶，100℃水浴或微波炉加热至琼脂糖融化均匀。

6.4 电泳胶模和点样梳子固定好。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

6.5 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子，保持点样孔的完好。

6.6 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。

6.7 将1、3、5?l DNA样品与1?l 的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。

6.8 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。

6.9 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。

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6.10 电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1～3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。

七、说明及注意事项

8.1 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。

8.2 EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶液在弃置前应当进行净化处理。

8.3 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。

八、思考题

如何检测、评价提取的DNA的质量？

九、记录及分析

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第二篇：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖凝胶电泳原理：

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。

琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 ℃时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。

由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。

目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：

(1) 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

(2) 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98%~99%)，近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

(3) 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

(4) 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺

(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N'- methylenebisacrylamide)聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低 pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。