植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测
（20##级生态班实验方案）
一、 实验目的
1. 理解用CTAB法提取植物组织DNA的原理。
2. 掌握CTAB法提取植物组织DNA的方法。
3. 了解真核基因组DNA的有关特性。
二、 实验原理
由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一般的提取真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三乙基溴化铵（cetyltriethy lammonium bromide, CTAB）法是常用的提取植物细胞基因组DNA的方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）时，CTAB-核酸复合物是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
植物DNA的提取程序应包括以下几项：①必须破碎或消化细胞壁释放出细胞内容物；②必须破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，常用CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解；③DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方法比较简单，适用于大多数植物。虽然得到的DNA纯度不是很高，但仍能满足限制性内切核酸酶分析或PCR扩增的要求。
三、 实验材料、试剂和仪器
1. 材料
新鲜的植物组织（如幼叶、花器、幼根）或-80℃冻存的材料。
仪器、用具:离心机、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪、电泳槽等。
2. 试剂
（1） 2 x CTAB缓冲液:
CTAB(W/V) 2%
Tris-HCI pH 8.0 100 mmol/L
EDTA pH 8.0 20 mmol/L
NaCl 1.4 mol/L
PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 1%
（2） TE缓冲液(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。
（3） 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
（4） β-巯基乙醇
（5） 70%乙醇
（6） 乙醇或异丙醇
（7） 5×TBE 电泳缓冲液（1L）：
Tris 54g
Na2EDTA·2H2O 3.72g
硼酸 27.5g
临用前稀释至0.5×TBE 电泳缓冲液
（8） 6×上样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖
四、实验步骤
（一）植物DNA提取
1．在5 mL离心管中，加入1000 μl的2×CTAB, 65℃预热。用前加入20 μl β-巯基乙醇。
2．取嫩的组织材料0.5-1 g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。
3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一5 ml新管中。
4．吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。
5．加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。
6．弃上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O或TE缓冲液中。
7．用紫外分光光度计在260 nm、280 nm波长分别读数。其中260 nm读数用来估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280的值用于估计DNA的纯度。1个OD260值相当于50μg/ml双链DNA。
样品浓度(μg/ml)=OD260 x 稀释倍数 x 50
对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈1.8。OD260/OD280>1.8说明有RNA污染；OD260/OD280<1.8说明有蛋白质污染。
注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、多糖含量高，在提取缓冲液中应提高ß-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚: 氯仿:异戊醇抽提一遍，这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高。
（二）琼脂糖电泳检测DNA
制作0.8%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液 10 μL+ 4μL上样缓冲液，电泳检测。用λDNA做分子量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明DNA完整，没有降解。
（1） 制胶槽水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与制胶槽之间留1mm空间。
（2） 称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解（每块胶用20 ml左右融化的0.8%的琼脂糖凝胶，每两组配50ml 0.8%的琼脂糖凝胶）。
（3） 取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至60℃左右（手握烧瓶可以耐受），即将凝胶溶液倒入制胶槽中。
（4） 室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。
（5） 在电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。
（6） 取一PE手套（用PE手套混合样品和上样混合液，样品总体积不宜超过15μL），如下表所示准备电泳样品，用移液器混匀。
（7） 用加样器吸取样品。依次分别加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。
（8） 接通电源，调节电压至80伏，电泳直至溴酚蓝指示剂距胶底1cm处，将凝胶板取出，用凝胶成像系统成像或者在紫外灯下观察结果，拍照。
第二篇：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖凝胶电泳原理：
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 ℃时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：
(1) 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。
(2) 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98%~99%)，近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
(3) 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
(4) 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺
(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N'- methylenebisacrylamide)聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低 pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。