一、实验原理

叶绿素是植物光合作用色素，主要有 chla chlb ， 不溶于水 ,可溶于酒精.丙酮和石油醚。叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应。叶绿素 分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇 ( 植醇， phytol) 的“尾巴”。卟啉环中的镁原子可被 H、 Cu、 Zn所置换。用酸处理叶片， H ＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。

叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。原因是当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited state）。叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光。寿命很短。处于第一三线态的叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光。

二、实验目的

1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法。2．观察叶绿体中的各种色素。3．掌握叶绿素的物理和化学性质

三、实验用品

1．材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜结晶、KOH-甲醇溶液等。2．仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、研钵、试管、具塞锥形瓶等等。

四、方法和步骤

1、叶绿体色素的提取

? 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或碳酸钙和 10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加 15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素。

? 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有 15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。

? 沿分液漏斗的壁小心加入 30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。再加入 30mL蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油醚中残留的丙酮，弃去水层。共洗两次。将色素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用黑纸包好备用。

2、叶绿体色素的观察

取一张色层分析纸或定性滤纸代用，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环,由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。

3、叶绿素含量的测定

取1 ml叶绿素提取原液移入至10 ml容量瓶， 石油醚定容(稀释液)，以石油醚作为空白对照，测OD652

? 叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )

? 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重

4、叶绿素理化性质的观察

? 光对叶绿素的破坏作用，在 2支具塞试管中各放入 2mL上述色素石油醚提取液，盖好塞子。一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经2—3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。

? 叶绿素的荧光，取 2mL上述色素的石油醚提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂直的方向观察叶绿素暗红色的荧光。

? 叶绿素的皂化反应，取 1 -2mL上述色素的石油醚提取液一试管中，逐步加入2 -5mL新配制的30% 3KOH-甲醇溶液，用力振动试管后静止分层，观察上下层溶液的变化。65℃水浴5 min；取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。

? 去镁叶绿素的形成，取 1 -2mL上述石油醚提取液放入试管中，小心加入 3mL 6mol/L HCL，摇动后静止分层观察溶液颜色变化。

? 铜的取代作用，取 1 -2mL色素的丙酮提取液于试管中，加入 3mL6mol/L HCL，摇动试管，再逐步加入醋酸铜结晶（把试管放进65℃水浴中微微加热），可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色，说明铜取代了氢占据在镁在叶绿素中的位置。 ＋2 ＋2 ＋

五、 思考及讨论题

1 ． 铜的取代作用可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色的原因？2． 叶绿素的皂化反应的原理？

第二篇：叶绿素的提取分离及含量测定

叶绿素a、b含量测定

【实验目的】

熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

【实验原理】

如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

如图3-3叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：

OD₁=C_a·k_a1+C_b·k_b1         （1）

OD₂=C_a·k_a2+C_b·k_b2         （2）

式中：C_a为组分a的浓度，g/L；

C_b为组分b的浓度，g/L；

OD₁为在波长λ₁（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；

OD₂为在波长λ₂（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；

k_a1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ₁时的光密度OD值；

k_b2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ₂时的光密度OD值；

k_a2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ₂时的光密度OD值；

k_b1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ₁时的光密度OD值；

从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：

将表中数值代入上式（1）、（2），则得：

OD₆₆₃=82.04×C_a+9.27×C_b

OD₆₄₅=16.75×C_a+45.60×C_b

经过整理之后，即得到下式：

C_a=0.0127 OD₆₆₃-0.00269 OD₆₄₅

C_b=0.0229 OD₆₄₅-0.00468 OD₆₆₃

如果把C_a，C_b的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：

C_a =12.7 OD₆₆₃-2.69 OD₆₄₅           （3）

C_b =22.9 OD₆₄₅-4.68 OD₆₆₃           （4）

C_T = C_a+ C_b=8.02 OD₆₆₃+20.21 OD₆₄₅   （5）

（5）式中C_T为总叶绿素浓度，单位为mg/L。

利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（mg/L）。

[附注]  由于叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），对仪器的波长精确度要求较高，一般低级类型的分光光度计难以满足要求，至少要中级或高级类型的。而有时还由于仪器受振等原因，会使仪器的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就差了。如果对测定结果发生疑问时，不妨用已知波长的滤光片验证一下，仪器的波长是否正确，如无滤光片，可用商品叶绿素a或b（厂家会标明λmax 数据），对仪器的波长进行验证。由于所需的叶绿素a或b的量很少，又无正确浓度要求，因此不妨自行制备，用纸层析法很快就能分离得到。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有0.5%丙酮的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。

【器材与试剂】

1. 实验仪器   高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管

2. 实验试剂   丙酮、碳酸钙

3. 实验材料   植物叶片

【实验步骤】

1. 色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放入研钵中加纯丙酮5 mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5 mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清夜用80%丙酮定容至20 mL。

2. 测定光密度：取上述色素提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。

3. 按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。

【注意事项】

1. 由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2. 由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。