一、引言
酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 7×12μm，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见， 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2 、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖 。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
二、实验仪器与材料
样品：新鲜苹果（未经清洗）榨汁。
YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. （每次根据需要量按如此比例配置，下同）
PDA培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121℃灭菌30分钟。）
PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。
器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
三、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
1．酵母菌的分离初筛
1）菌种采样
随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。
2）富集培养与纯种分离
方法：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28℃恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28℃恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。
2．酵母菌种的复筛
以无琼脂PDA培养液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 ℃的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL无琼脂PDA培养液，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 ℃下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。
3．酵母菌的耐受性试验
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（4%、6%、8% ）、二氧化硫（20、40、60 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。
活化条件：28 ℃条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；
接种量：1×107 cfu/mL（各菌种浓度在同一数量级即可）。
1）耐酒精度试验
按下表在试管中加入培养液。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标4、6、8，按下表每管加入各量：
2） 耐SO2试验
按亚硫酸含量为6% 计， 计算出20、40、60 mg/L浓度所需的量，分别加入到培养液中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入培养液，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量≥6%），加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1×107个，28℃静止培养。观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：
四、实验结果
1）发酵力测定
2）耐酒精度性质测定
3）耐SO2浓度测定
五、结论
1）发酵力实验
如上，个发酵液整体失重走势相同，过程有个回升现象是由于在第4天测定前开盖放气且其他时间均未开盖放气的结果，应该是氧气含量的增加使得发酵增强，且发酵液中还生长有好氧细菌，所以导致空白对照也上升。从图可以看出，前期A菌属于优势发酵菌，后期B菌成为优势发酵菌，发酵力强，C菌则发酵力最弱。
2）耐酒精性质实验
见上图，在设定的梯度上，随着酒精度的增加，酵母菌产气量降低，说明一定浓度酒精抑制其生长。还可以看出，B菌耐酒精度较好，但C菌在低浓度酒精条件下有很好的适应性。
3）耐二氧化硫浓度实验
如上图所示，在设定的浓度梯内，随着SO2浓度的增高，菌体产气量降低，说明，一定范围内高浓度的SO2抑制酵母菌发酵。就总体而言，B、C菌在设定的二氧化硫浓度里均具有较好发酵能力，当相对而言B菌耐SO2能力更强。
综上：参考如上结果，B菌是最适合用于发酵的酵母菌菌种。
感想
第二篇：果酒酵母发酵
北方民族大学
实验报告
学院：生物科学与工程学院
专业：生物工程
实验题目：果酒酵母发酵
班级：生物工程101
姓名：0000
学号：20103374
四组成员：
果酒酵母发酵
选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。
一、实验目的和内容
1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。
2．用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精）。
二、实验原理 果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：
果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。
果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。
三、实验仪器与材料
样品：新鲜水果及压榨汁。
试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土；
器皿：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5×1.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30 ℃），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。
四、实验方法与步骤
1．自选酵母发酵性性能的检测试验：用筛选菌种发酵果酒
（1）果酒酿造的工艺流程
鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→ 发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品
（2）工艺简述
1）发酵前的处理
前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。
①破碎、除梗： 破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。
②二氧化硫处理： 二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。（以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：[葡萄果实×70%×60]/[0.06×1000]。）此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加 。
2）果汁的调整： 取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度。
①糖的调整： 酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20°Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。
②酸的调整： 酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸。
3）酒精发酵
发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28 ℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。残糖降为0.4%以下时主发酵结束。
糖度的测定：费林试剂比色法
试剂：费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。
费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。
0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。
2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。
操作步骤 ：
1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。
2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和比预备试验少 1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。
计算
式中： F——费林溶液A、B各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。
3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于 100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为 0.2～0.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（4）计算。
4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为 0.2～0.4 g，加 5 mL盐酸溶液，加水至 20 mL，摇匀。于 68±1℃水浴上水解 15 min，取出，冷却。用200 g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）。调温至 20℃，加水定容至刻度（V2）。吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。
式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果应表示至一位小数。
酸度的测定：中和滴定法
试剂 酚酞指示剂溶液，10g/L ：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L。
1）配制
将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。
2）标定
称取0.6 g于105～110 ℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001 g。溶于50 mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。
3）计算
按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C＝ m/(V1-V2) ×0.2042
式中：C ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； m ——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V ——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1 ——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.20##——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。
操作步骤
1）样品的测定
取调温至20 ℃的样品2.00-5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。 起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。
2）空白的测定
吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。
3）结果计算
按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：
式中：X ——样品中滴定酸的含量，g/L；c ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1 ——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0 ——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； V2 ——吸取样品的体积，mL； Si ——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。 S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045
酒度的测定：蒸馏法
材料 全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。
操作步骤
1）用一洁净、干燥的 100 mL容量瓶准确量取 100 mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温 20℃）于500 mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL
2）将试样倒入洁净、干燥的100 mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。所得结果表示至一位小数
结果分析
一）主发酵各时期的特征：
（1）发酵初期,主要是酵母菌的繁殖阶段
特征: 液面平静 气泡产生 品温渐高
甜味尚浓 比重较大 酒味产生
（2）发酵中期，主要是酒精发酵阶段
特征: 气泡剧增 液面沸腾 酒帽浮起
品温高升 甜味渐淡 酒味渐浓
（3）发酵末期
特征: 气少液平 品温渐低 甜味极淡
酒味最浓 浮渣下沉 酒液变清
二）糖度随时间的变化
果浆中含糖量随时间的变化曲线
三）酸度随时间的变化
四）酒精度
通过蒸馏法测得酒精度为8℃.。
结论
通过实验得出影响酵母生长和发酵的主要因素
1.温度：最适生长温度25~28 ℃；13~14℃发酵起动困难，随温度升高发酵加快，35℃ 酵母衰老快
2.压力：0.8MPa停止酵母的生长繁殖，1.4MPaAF（酒精发酵:酵母菌将葡萄浆果中的糖分解为酒精、 二氧化碳和其它副产物，这一过程称为AF）停止。用外加0.8MPa CO2防止酵母生长繁殖。
3.酸度：pH 3.3~3.5
4.糖：1~2%发酵速度最快，5%开始有抑制作用，25% 发酵延滞，70%大多数酵母不能生长和发酵。
5.SO2：添加10mg/L可看出对AF的延迟作用，1.2~1.5 g/L能杀死酵母等微生物，保存葡萄汁
6.发酵代谢产物：酒精和CO2是主要代谢产物，对AF有抑制作用。中间产物脂肪酸对AF也有抑制作用
误差分析
1.在榨果汁期间没有及时加入亚硫酸，是果汁变色。
2.向果浆中加入安琪酵母时，没有将酵母完全活化。
3.测糖测酸的途中，没有控制好滴定终点，使测量不准确。