生物化学实验报告
实验三 酵母核糖核酸的提取及测定
一、研究背景及目的
RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。[1]可见，无论是科研工作还是商业产品的生产过程，都需要大量的纯品RNA作为原料。但是RNA的活化能较高，不易直接合成，而天然材料中的RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，故采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA就显得至关重要。目前，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。
本实验中，我们需要了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路，掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节，并以酵母为材料学习RNA提取和测定的基本操作方法。
二、原理
1.选材
即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料的易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料，本实验中我们以食品用干酵母粉直接作为RNA提取的原料。
2.提取
此处需要明确科研与工业生产的差异。科研工作中，通常需要得到有活性的RNA分子，以研究其生物学功能，故在提取过程中需要保证一级结构不被破坏，而后通过一定的手段使其恢复到正确的空间结构。所以在提取过程中动作要轻柔，避免机械力（如气泡破裂等）打断RNA链，另外，提取时较多的使用了有机溶剂。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。此外实验室所广泛使用的RNA试剂盒使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子实现了可能。
然而在大工业生产中，要求降低成本，只需获得纯品核苷酸，没有必要保证RNA链的完整性，且方法需要适合机械化生产的流水线，因此工业制备RNA常采用浓盐法和稀碱法，用这两种方法所提取的均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。两种方法的原理不同，浓盐法是原理是即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中；稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。本实验中，我们使用浓盐法提取RNA。[3]
3.分离与纯化
在提取时我们使用了沸水浴，这不仅使细胞破碎，RNA释放，同时让相当多的一部分蛋白质变性，疏水氨基酸暴露，溶解性下降，生成沉淀。经过冰浴冷却，温度骤降，热变性蛋白发生错误折叠形成足够稳定的构象而并非原来的空间结构。这样，离心之后，母体残渣和热变性蛋白与溶解在上清液中RNA得以分离。随后，根据核酸的两性特点，采用等电沉淀法，调节体系pH 2.0，使RNA以沉淀形式析出。在分离RNA的同时，也除去了一部分DNA和蛋白质等杂质。最后，利用95%的乙醇洗涤RNA沉淀，由于RNA不溶于乙醇，而其他脂溶性物质溶于乙醇，这样就除去了少量的其他脂溶性杂质。
4.含量测定
测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。三种方法各有特点，但考虑到学生实验的操作时间、安全性及实验器材等可行性因素，我们在本次实验中用比消光系数法（以紫外法为基础）测定RNA的OD260值，计算溶液中的RNA含量，最终得出制品纯度和RNA提取率。
三、仪器与试剂
仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、FA1004电子分析天平（上海精密仪器科技厂）、DL-101-3BS电热鼓风干燥箱（天津市中环科技开发公司）、电磁炉；
器具：微量可调手动移液器（大龙）、具塞刻度试管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研钵；
试剂：10%的NaCl溶液、6M HCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀剂、蒸馏水；
材料：食品用干酵母粉（湖北安琪酵母股份有限公司）。
四、实验步骤
1.粗提取：量取50ml 10%的NaCl溶液，称取7g酵母粉，研磨至面粉状，在研钵中加入10ml 左右的NaCl溶液并研磨成糊状（没有肉眼可见的块状颗粒），将糊状物及剩余NaCl溶液转移至三角瓶，沸水浴浸提至少40min。
2.分离：取出提取液，冰浴冷却10min，转入离心管，3500r/min离心30min，取上清液。
3.沉淀：将上清液转移至小烧杯中，冰浴冷却至10℃以下。搅拌下（不要过分剧烈）加入6M HCl调节至pH 2.0，冰浴4h。
4.洗涤：轻柔而彻底地搅拌使沉淀充分悬浮，将悬浊液转入离心管，3500r/min离心15min，取RNA沉淀。用约15ml 95%的乙醇彻底悬浮搅拌洗涤沉淀，3000r/min离心10min。洗涤离心3次，弃去上清液。
5.干燥并称重：取预先在80℃烘箱内干燥的硫酸纸精确称重，再将边缘折起成框，备用。将洗涤后的RNA沉淀转移涂布于硫酸纸上，80℃烘箱干燥至沉淀成粉末状。准确称量干燥后的RNA制品及硫酸纸总重并记录。将大部分RNA制品转移至玻璃匀浆器中，称量剩余沉淀连同硫酸纸的重量并记录。
6.含量测定：向玻璃匀浆器中加入约5ml蒸馏水，充分匀浆至均一的胶体溶液（匀浆器底部无块状颗粒），转移RNA至洁净的小烧杯中，用10~15ml蒸馏水分次洗涤匀浆器，并入小烧杯，充分混匀。加入2%氨水调pH至7.0，转移至25ml容量瓶中，定容混匀。取两只试管编号为A、B，A试管加入5ml RNA和5ml蒸馏水，B试管加入5ml RNA和5ml沉淀剂，充分混匀，冰浴20min后转入离心管中，3500r/min离心10min。取上清液于另两试管，混匀之后各取0.5ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水定容混匀。首先以B管作为空白管用紫外分光光度计测定A管的OD260值，随后以蒸馏水为空白管用紫外分光光度计分别测定A、B两管的OD260值，准确记录以上各数据。
五、数据整理及图表
表1 核糖核酸的提取数据整理
表2 核糖核酸含量的测定数据整理（B管为空白管）
表3 核糖核酸含量的测定数据整理（蒸馏水为空白管）
六、结果计算与讨论分析
1.结果计算
1制品纯度（%）=
×定量样品稀释倍数×
×100%=
×25×2×100×
×100%=75.5%
2产率：RNA提取率（%）=
×100%=
×100%=1.64%
2.讨论与分析
（1）本实验最终计算得到的制品纯度为75.5%，RNA提取率为1.64%。
（2）紫外法测定RNA含量时，用B管作为空白管得到的样品光吸收为0.488，以蒸馏水为空白管测得的样品光吸收为0.592。
（3）本实验操作相对较为简单，数据处理也比较容易，难点是对相关操作细节的理解与把握。一些操作细节的作用在原理、质疑及思考题等部分已做详细的说明，此处不再分析赘述。
七、结论与展望
（1）紫外法测定RNA含量时，以B管为空白测定A管光吸收与以蒸馏水为空白分别测定A、B两管的光吸收最终结果相差不大，说明两种方法本质上来说是一样的，且都是可行的。
（2）本实验纯化RNA最主要的步骤便是利用等电点沉淀法使RNA与杂质分离。我们知道，蛋白质是杂质中的一大类物质，且蛋白质具有诸多的理化性质用于分离。会不会存在合适的方法可以直接将蛋白质直接从RNA溶液中分离出来，达到除杂的目的呢？
（3）通过本次实验，我们对生物制剂的开发和应用等一系列思路有了初步的认识，同时了解到了实验室研究与工业生产之间的异同。在这里我想简单谈一下本次实验后个人对工业生产的一点认识：
在工业生产中需要考虑的首要问题就是经济效益，从原料的选取到每一步生产流程，都尽可能的实现效益最大化；另外，工业生产也是要有前期投入的，如购买相关仪器设备等，且前期的资金投入有时会具有一定的风险性，但一个聪明的生产厂家必须能够正确处理好前期投入与后期回报之间的关系，决不能使企业一直处于亏损状态；最后就是工业生产中要注意废物的循环利用，资源再生，这不仅是响应国家节约资源、发展循环经济的一句口号，更是工业生产中难得的商机。
八、质疑与相关思考
（1）关于浸提时间的设置，查阅资料[3]了解到工业上的浸提时间从2~5h不等（与本实验40min差距较大），课堂上老师已经提及原因是由于学生实验的时间有限，浸提时在保证效果的同时采用最低时间。
（2）RNase无处不在，本实验是如何考虑的？
从产品定位上来说，本实验最终要获得的并不是有活性的RNA，故不需要保护其一级结构的完整性，因而RNase的存在与否对产品来说无关紧要，但对产率却有影响。再者，本实验用浓盐法提取RNA时直接将温度升至90~100℃浸提，避免在20~70℃停留时间过长，就是为了抑制磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的活性，避免RNA被降解而降低提取率。
（3）本实验测定RNA含量为何不用定磷法而使用紫外法？
定磷法操作相当繁琐，需绘制标准曲线、测样品总磷量和无机磷含量，耗费时间长，另外操作中使用大量的试剂甚至一些有毒试剂（如浓硫酸），具有一定的危险性。相比较而言，紫外法简便、快速，易于操作，考虑到学生实验的时间限制以及实验器材等可行性因素分析，本实验依旧使用紫外法测定RNA含量
（4）用紫外法测定RNA时为什么不设平行管？
我们知道，平行试验是对同一样品进行两次以上的测定以判断其结果的一致性，通过平行试验求得平均值可减小实验测定误差。在以前的蛋白质含量测定以及酶活力测定实验中，我们都设置了平行管。查阅相关文献[2]发现在使用定磷法测定核酸含量时待测样液都做了两个平行，而使用紫外法测定时待测样液都没有做平行。个人判断此事绝非巧合，但却百思不得其解，求指教。
九、思考题
1.本实验为何选用酵母作为生产原料？在分离纯化的实验选材上有哪些主要原则？
从选材上来说，由于微生物生长繁殖速度快、代谢旺盛，且原料较易获得，常被用作提取核酸的原料。本实验选用酵母作为生产材料，基于以下两方面的原因：（1）酵母细胞富含核酸，且RNA含量丰富，为菌体干重的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%~0.516%。（2）材料易获得，成本较低。工业上发酵产生的废啤酒酵母占啤酒工业副产物的2.5%，而利用这些废酵母提取RNA并生产出相应的制品，变废为宝，具有很大的商业利益，同时符合当前国家提倡的低碳环保、废物循环利用的生产模式。本实验的一个目的就是模拟学习工业生产RNA的方法以掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节，考虑到小规模学生实验选材的易获得性及廉价性，以干酵母粉为实验材料。
实验选材上需把握以下几个原则：（1）材料所含分离纯化的目标物要丰富；（2）材料要容易获得；（3）由该材料所设计出的分离纯化方法要简便可行且适于工业化大规模流水线生产；（4）综合成本要降到最低，以谋求最大利润。
2.浓盐法的选择是基于怎样的考虑？
目前工业上常用的提取RNA的方法有浓盐法和稀碱法，两种方法各有特点：浓盐法的破壁率低，但提取的RNA纯度比稀碱法要高；稀碱法的破壁效果好，消耗时间短，能耗低，但提取RNA纯度较低（碱性条件下RNA易被水解），适于工业化生产。[4]因为工业生产需要综合考虑效率、成本等问题使利益最大化，不需要高纯度的RNA制品，故多采用稀碱法；而学生实验旨在培养学生的技能，且在实验室相对成本而言对产品的纯度更为看重，故本实验选用浓盐法。
3.本方法为何选用等电点沉淀作为最主要的纯化步骤？
RNA是两性物质，在等电点时溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，故溶解度最低。RNA的等电点为2.0~2.5，DNA等电点为4~4.5，本实验中我们调节pH2.0，一方面使RNA较多地沉淀下来，另一方面由于拉大了与DNA等电点的差距，使得在该pH下杂质DNA较多溶解在溶液里，且会发生水解。此外，蛋白质也会在溶液中有一定的溶解度。该步操作既分离得到了RNA，又一步除去了相当多的杂质，使效益达到了最大化，是最主要的纯化步骤。
4.DNA的去除本方法是如何考虑的？
DNA的去除有以下几个考虑：（1）由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，离心后可随母体残渣一起除去；（2）10%的NaCl溶液中DNA溶解度很小，大部分以沉淀形式存在于溶液中，离心后也会除去；（3）调节pH2.0使RNA进行等电点沉淀时，DNA溶解于溶液中，RNA沉淀出来，再次对DNA进行了去除。
5.大量的乙醇洗涤在工业生产上有否危险隐患？厂家是如何考虑的？
乙醇属于易燃品，乙醇泄露有可能引发火灾甚至爆炸，所以工业上大量的乙醇洗涤是存在安全隐患的。
在实际工业生产中，厂家需要优先考虑的是生产成本及效益。首先，乙醇是一种廉价但又非常好的溶剂，它可以溶解许多的无机物及多种有机物，用它作为洗涤剂来去除RNA样品上含有的无机盐（NaCl）和一些脂溶性杂质是再合适不过了；其次，乙醇易挥发，用其洗涤后的RNA沉淀不需要非常繁杂的干燥程序，风干即可；再者，乙醇还具有消毒的作用，洗涤后的产品不易受微生物的侵染而变质腐败，延长了保质期；最后，乙醇使用过程中只要采用合理的管理与监测手段（如乙醇报警器等），是可以避免危险发生的。综合以上各点，只要前期投入一部分资金用于乙醇使用时的检测与管理，后期工业生产中便会带来巨大的经济效益，所以明智的厂家当然还会选择乙醇洗涤沉淀。
6.本实验在用紫外法测定RNA含量时，为什么要固定溶液的pH值？若pH值不固定会影响测定结果吗？为什么？
在测定RNA含量之前需用2%氨水调pH7.0。这样做的原因有以下几个：（1）核酸在过酸或者过碱条件下，双螺旋区会发生氢键断裂，紫外吸收升高，这种现象称为增色效应。此外在不同pH溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收也随之表现出明显的差异。而紫外法通过测定OD260值来计算RNA含量，因此需要排出相关变量对紫外吸收的影响。（2）核酸的摩尔消光系数（比消光系数）ε（ρ）并不是一个确定的值，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化，其经典数值均是在pH = 7.0条件下测得的，故使用比消光系数法测RNA含量时需要调节pH7.0。（3）生理pH7.0条件下有利于核酸的溶解，使核酸样品尽可能多的溶解，测定结果更准确（次要原因）。
pH值不固定肯定会影响到测定结果的准确性，原因上文已经分析。
7.在测定中，加入钼酸铵-过氯酸沉淀剂的作用是什么？离心除去沉淀后，其上清液为什么需要稀释100倍？
加入沉淀剂的目的是使B管的RNA全部沉淀下来，离心后用其上清液作为空白管调节仪器100%T，再测定A管RNA浓度，从而排除测定体系中除了特异性光吸收本体物质（RNA）之外的其他物质对溶液光吸收的影响。
测定前将溶液稀释100倍的原因是：（1）使吸光度值落在朗伯-比尔范围内（一般对核酸来说是0.2~0.8），在该范围内吸光度与RNA浓度呈较好的线性关系，测定结果也更加准确。（2）减弱甚至消除过量的沉淀剂对吸光度的影响。B管同样稀释了100倍，B管与A管相比，溶液中除了相差RNA之外，还有可能多出一少部分过量的沉淀剂，而该沉淀剂是有可能对溶液的光吸收产生影响的，将溶液稀释就可以降低它的影响。
十、实验小结
1.整个实验中搅拌过程一定要缓慢，否则会使RNA机械破碎，影响含量测定。
2.水浴或者冰浴刚开始时应该用玻璃棒搅拌溶液约1min左右的时间，使溶液中间的温度与边缘温度尽快达到相同，避免出现局部温度的不一致。
3.调节等电点时应严格控制pH。因为pH过低会使核酸发生酸性水解，过高则核酸沉淀不完全，且会使杂质（DNA或蛋白质等）沉淀较多。故滴加溶液的速度应由快到慢，当pH接近等电点时可逐滴加入甚至半滴或四分之一滴加入。
4.匀浆时，会有一部分固体粘在匀浆器的底部不易分离，需用玻璃棒将其刮下继续匀浆至底部无固体残留且溶液呈胶体状。
5.紫外法测定RNA含量时，第一次洗涤定容要格外小心，切勿超过总体积（容量瓶量程小，只有25ml）。
6.本实验过程中涉及到两次调节溶液pH，第一次为6M HCl调节RNA等电点pH2.0，第二次为RNA含量测定时2%氨水调pH 7.0。注意两次所使用的试纸和比色卡不一样。
7.实验间隙学习了枪的校正方法，并对自己使用枪平行量取液体的一致性有了认识。
8.建议每四个实验小组配备一台pH计，可以节省不少时间，同时又能提高实验的准确性。
十一、参考文献
[1] 应国清，石陆娥，唐振兴.核苷酸类物质的应用研究进展[J].广州食品工业科技，2004，20（02）：126~128.
[2] 乔宾福.实用微生物技术[M].上海:上海科学技术文献出版社，1994.
[3] 王战勇，孔俊豪.浓盐法和稀碱法提取啤酒废酵母核糖核酸的比较[J].化学与生物工程，2007，24（02）:60~62.
[4] 王琪琳.酵母核糖核酸的分离实验改进及其综合利用[J].生物学通报，2002，37（01）：53.