生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验目的

1. 掌握薄层层析法的一般原理。
2. 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。
3. 掌握如何根据移动速率（R_f值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。

二、实验原理

(一)           薄层层析

1.层析技术是利用化合物中各组分的物理性质（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终被分离。

1)   特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可用于大量物质的分离纯化和制备。

2)   固定相：固定相是层析的一个基质。包括固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。

3)   流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。

4)   分类

（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析，前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。

（2）按操作形式不同，可分为柱层析、薄层层析和纸层析。

（3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。

今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄层层析，合到一起叫：吸附薄层层析。

2.薄层层析法是色谱分析技术的一种

一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）

3.硅胶吸附薄层层析

1)  吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 :

硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.

2)  硅胶吸附薄层层析的特点：

（1）   硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

（2）   硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

（3）   硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。

(二)           氨基酸与茚三酮的显色反应

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

(三)           混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—R_f值（rate of flow）来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为R_f值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（R_f值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法：

(一)           实验材料

1.        试剂

1)   分析样品：氨基酸混合液

2)   吸附剂：硅胶

3)   粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠

4)   氨基酸的异丙醇溶液

5)       丙氨酸、精氨酸、甘氨酸

6)   展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）

2.        仪器与器材

1)   层析板、尺子、铅笔

2)   烧杯、玻棒、量筒

3)   吹风机

4)   毛细管、层析缸

5)   药匙

6)   烘箱

(二)           方法与步骤

四、结果与讨论：

1.        结果与计算

 

根据表格数据计算，混合氨基酸溶液中共有三种氨基酸。

2.        分析与讨论

1）点不可以太大，容易造成拖尾。

2）选取数据找斑点中心，较为准确。

3.        复习与思考

1)        硅胶的吸附力与含水量的问题

其吸附活性也与含水量呈负性相关

2)        吸附实验中吸附剂的选择根据

A、硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

B、硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

C、硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。

3)        氨基酸纸层析，两者有何区别

按操作形式不同

第二篇：氨基酸分析,氨基酸分析包

氨 基 酸 分 析 包

氨基酸在制药和保健品市场的普遍应用，对氨基酸的分析测试也越多，以往多采用氨基酸自动分析仪测定其含量。由于该自动分析仪价格很贵，操作复杂，色谱柱只能用价格昂贵的氨基酸分析柱，并且只能作氨基酸分析别无它用，故一些厂家不具备该条件，为解决上述问题，我公司开发了一种准确﹑可靠氨基酸高效液相分析方法。此方法具有操作简单，厂家不用投资设备，就象分析其它样品一样的成本定量分析氨基酸。以下是我们测试的谱图。

氨基酸分析包

名称:氨基酸分析仪

说明:

SI45000氨基酸分析仪

仪器简介：

SI4500氨基酸分析系统,它包括专用泵、专用检测器、专用控温箱、专用氨基酸分析包。分析系统由流动相输送、分离、检测和数据处理等四部分组成,可广泛用于氨基酸的定性和定量分析。对于各种蛋白质水解液中混合氨基酸的定性和定量检测、溶液中的氨基酸含量检测十分便捷。

主要技术指标：

淋洗液流量：1.0

淋洗液种类：超纯水、A液、B液

进样量：5ul

柱温：30-40℃

检测器：氨基酸专用检测器

我公司开发的SI4500氨基酸分析系统，和分析其他产品一样快速分析氨基酸,进样分析时间35分钟就可以完成.我们流动相为常用的色谱试剂容易购买。

此氨基酸分析仪由我公司与天津氨基酸研究所联合开发的科学性氨基酸分析系统。中国氨基酸分析药典由天津氨基酸研究所联合起草，所以是国内氨基酸全威。我们联合开发的技术指标，分析仪在美国定制，是国内性价比最高的氨基酸分析系统。

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单位名称：天津谱祥科技有限公司

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