纸层析法测定肝组织的转氨基作用
【目的】
1 ．掌握纸层析法的原理和方法。
2 ．熟悉相关转氨酶的临床意义。
【原理】
转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α - 酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶，能催化α - 酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。反应式如下：
纸层析是以滤纸作为支持物，与滤纸纤维素结合的水（约占纸重 20 ～ 30 ％）称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析过程中或层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（ R f ）表示：
同一氨基酸在相同的层析条件下 R f 值相同，不同氨基酸在相同层析条件下 R f 值不同， 因此可以根据 R f 值来鉴定被分离的氨基酸。层析时，用显色剂茚三酮使氨基酸显色，将样品氨基酸的 R f 值与标准氨基酸的 R f 值比较，即可确定所分离氨基酸的种类。
【器材】
1 ．研钵
2 ．剪刀
3 ．恒温水浴
4 ．点样毛细管
5 ．漏斗
6 ．表面皿或小平皿
7 ．新鲜动物肝脏
8 ．直径 10cm 圆型新华滤纸
9 ．中试管和小试管
10 ．电炉或吹风机或烘箱
11 ．直径 10cm 的培养皿
【试剂】
1 ． 0.2mol/L ， pH7.4 磷酸缓种液
Na 2 HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液 19ml 混匀，再用蒸馏水稀释 20 倍。
2 ． 0.1mol/L 丙氨酸溶液
称取丙氨酸 0.891g 先溶于少量 pH7.4 磷酸盐缓冲液中，以 0.1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。
3 ． 0.1mol/L 谷氨酸溶液
称取谷氨酸 0.735g ，先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 50ml 。
4 ． 0.1mol/L α- 酮戊二酸溶液
称取 α- 酮戊二酸 1.46g 先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中，以 1mol/L NaOH 仔细调至 pH7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100ml 。
5 ．层析剂（展开剂）
取 100ml 重蒸苯酚与 25ml 水摇匀，加入茚三酮使终浓度达 0.1% 。
【操作】
1 ．酶液制备
取新鲜的动物肝脏 1g ，放入研钵中用剪刀剪碎，取 9ml 冰冷 pH7.4 磷酸缓冲液，先加 2ml ，迅速研磨成匀浆，再加入 7ml 。
2 ．保温（酶促反应）
取干燥中试管 2 支，分别标明测定与对照，各加入肝匀浆 0.5ml 。测定管放入 37℃ 水浴保温 10min ，对照管放入沸水浴中煮 10min ，冷却后于两管中分别加入 0.1mol/L 丙氨酸溶液 0.5ml ， 0.1mol/Lα- 酮戊二酸 0.5ml ， pH7.4 磷酸缓冲液 1.5ml ，摇匀，放 37℃ 水浴保温 1h ，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮 10min 以终止反应，取出冷却后，将测定管和对照管分别过滤，收集滤液于小试管中备用，并分别标明测定与对照。
3 ．层析与显色
取直径为 10cm 的圆型新华滤纸一张，用圆规作半径为 0.5cm 的同心圆，通过圆心作三条夹角分别为 60℃ 的直线（图 3-10 ），与同心圆相交叉为 6 个交点，按顺时针标记各点。在 1 、 4 两点分别点 0.1mol/L 丙氨酸溶液和 0.1mol/L 谷氨酸溶液 2 次。方法是用毛细点样管在滤纸上点样，注意斑点不要太大（一般直径约 0.3cm ），而且每点 1 次待晾干后再点第 2 次。照此方法，在 2 、 5 处各点测定管过滤液 3 次，在 3 、 6 两处各点对照管过滤液 3 次。
图 3-10 层析点样示意图
在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小），另取同类滤纸约 1cm 2 , 下一半剪成须状，卷成圆筒如灯芯，插入小孔，稍突出滤纸面即可。
将层析剂放入直径为 3 ～ 5cm 的干燥表面皿或小平皿中，表面皿或小平皿管置于直径为 10cm 的培养皿中，将要层析的滤纸平放在培养皿上，滤纸芯浸入溶剂中，而后在其上再盖一培养皿以封闭（图 3-11 ），这时可见层析溶剂沿滤纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，约 45min 后，等溶剂前缘距滤纸边缘 1cm 时即可取出，用电炉烤干或吹风机吹干或在 60℃ 烘箱中烘干，此时可见紫色的同心弧色斑出现，比较色斑的位置，计算各斑点物质的 R f 值，分析实验结果。
若两人一组，可将层析滤纸沿 1 、 4 直线裁开，两人分别保存留用。
图 3-11 层析示意图
【注意事项】
1 ．滤纸芯卷得不要太紧，且要呈圆筒状，否则，展层不呈圆形。
2 ．在点样前应将手洗净，手只能拿滤纸的边缘，以免手指的汗迹等污染显色，影响对结果的观察分析。
3 ．若用第一种展开剂，展层完毕，要划出溶剂前缘的轮廓，然后再干燥之，以便计算 R f 值。
4 ．展开剂在滤纸上的各个方向上移动的速度不完全相同。如顺纹理方向溶剂移动的速度要快一些。因此，计算 R f 值时不能一概而论。
【思考题】
1 ．测定 R f 值的意义是什么？
2 ．纸层析法分离氨基酸的原理是什么？
3 ．本实验中固定相．流动相各是什么？