实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定

一 实验目的

1．理解薄层层析原理，

2．掌握薄层层析技术，

3．学会氨基酸的较为精确的定性。

二 实验原理

1 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别(如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性)，使各组分在两个相中的分布不同，其中一个相是固定不动的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。

2 固定相：可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）

3 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂 。 4 层析技术利用

分离混合物 一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。

鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（ R f 值），

所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。

薄板层析:通常将吸附剂（载体）铺在光洁的表面上（如玻璃板、金属或塑料等），形成均匀的薄层。然后以流动相展开，样品中的组分不断地被吸附剂（固定相）吸附，又被流动相溶解（解吸）而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相有不同的解吸能力，因此，在流动相向前流动的过程中，不同组分移动的距离不同，因而得到分离。 5 薄层层析特点

装置简单，操作简便。展开耗时短，一般20－30min即可上行十几厘米。斑点扩散少，检出灵敏度高。（0.01ug）同一薄层析可用多种试剂显斑。加厚薄层后可用于制备。（50mg）

三 实验器材

1 材料

(1) 玻板 ：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

(2)固定相或载体 ：最常用的有硅胶G、硅胶GF<[254]> 、硅胶H、 硅胶HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F<[254]>等。 其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘

合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓

冲液的薄层。

(3) 点样器 同纸色谱法项下。

(4) 展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。

2 主要仪器

带密封盖的层析缸、毛细管(0.5mm)、100℃的烘箱、电吹风机、载玻片（75mm*25mm）、玻璃棒、药勺、烧杯（100ml）、量筒（10ml）、滤纸、喷雾器、直尺、铅笔。

3．试剂

（1）氨基酸标准溶液：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸10mg／m1水溶液。各25ml

（2）样品液：混合氨基酸的水溶液。25ml

（3）展开剂：水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5 500ml

（4）显色剂：0.5%茚三酮溶液（茚三酮O.5g溶于乙醇l00ml中。 ）

四、操作方法

1．硅胶G薄层板的制备

(1)清洗玻璃板：先用洗衣粉和水清洗干净，再经自来水淋洗，经酒精冲洗后放入烘箱烘干，取用时只能手指接触板的边缘。

(2)制备浆液：称取3g硅胶G于烧杯中，缓慢地加入9ml0.5%羧甲基纤维素钠溶液，边加边搅拌，加料完毕用玻璃棒剧烈搅拌调成均匀浆液。

(3)涂片：将调好的浆液倒在玻璃板上，将板倾斜使浆液铺开，再将板拿起用手左右摇晃，使浆液均匀附在玻璃板上，其厚度为0.25—1mm，然后用纸轻轻擦去薄板四周多余浆液（取拿板时只能触及板的顶部及两侧），把薄板放桌面上晾干。

(4)活化：将硅胶板于105~110℃烘箱内烘30min，取出冷却放在干燥器内保存备用（薄层活化温度一般不超过128℃，以免引起石膏脱水失去固着能力）。

2、点样

（1）在距离薄板一端约1-1.5cm处用细线向下压硅胶(用铅笔划一线)，压成一条点样线。

（2）用直径约1mm或0.55mm的玻璃毛细管分别吸取甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸及混合氨基酸溶液，在点样线上点样，每隔0.8cm处点一种样品（约5ul），与薄板垂直方向轻轻碰点样处点样，直径约2~3mm。待点样处干后（可用吹风机吹干），再将样品在原点样处重复点一次。

（3） 氨基酸的点样量以5ul为宜，含氨基酸0.5-2ug。

3、展开

（1）硅胶板的点样端向下，倾斜地放入层析缸内，使其与缸底平面呈约15-30度角。

（2）用长颈漏斗加入展开剂使展开剂离点样处1cm处为止。即点样端浸入展开剂深度约0.3cm－0.5为宜

（3）盖上层析缸盖进行层析。

（4）当溶剂前沿距上边缘１厘米处时，取出薄层板，立即用笔标出溶剂前沿的位置，将硅胶板置干燥箱烘干。

4、 显色

（1）用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂

（2）将玻板置105℃干燥箱内烘干，约10分钟左右即可显出粉红色斑点（脯氨酸为黄色）。

五、结果与计算

用大头针轻轻划出所有斑点的轮廓，再用尺量出每个斑点从原点至斑点中心的距离及原点至展开剂前沿距离，计算出Rf值。

氨基酸移动的距离（cm）

Rf值＝ 溶剂移动的距离（cm）

样品至色斑中心的距离（cm）

＝ 样品至溶剂前沿的距离（cm）

六、注意事项

1. 为了防止薄层被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套。

2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干薄层。

第二篇：实验一、氨基酸纸层析分离鉴定

实验一 氨基酸的分离鉴定————纸层析法

一 预习思考题

1.本实中滤纸的作用是什么？

2.实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？

3.Rf值的含义。影响因素？

4.两Rf值之差为多少范围内可以确定为同一物质？

5.层析滤纸和普通滤纸有什么区别？

6.为什么要平衡？平衡剂和扩展剂是同一物质吗？

7.用手直接接触滤纸会引起什么不良后果，为什么？

8.缝制的纸筒如果两边缘相靠会造成什么后果？

9.为避免实验结果出现“拖尾”现象，实验操作中应注意哪些环节？

10.标记滤纸不能使用油性笔，为什么？

11.查阅资料，解释纸层析分离氨基酸原理。

1.纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相。

2.以水相为固定相，展开的溶剂作流动相。

3.溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：

展开斑点中心与原点之间的距离/溶剂前某种沿与原点之间的距离

影响因素：在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构性质，溶剂系统，层析滤纸的质量，温度，样品溶液中的杂质等因素有关。

4.样品分离各组分一般Rf值在05~0.85之间，彼此间差值不应0.05，样品与标准差值<0.05基本确认为同一物质。 5.层析滤纸，组成该滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。普通滤纸，由棉质纤维组成，按不同的用途而使用不同的方法制作。由于其材质是纤维制成品，因此它的表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的固体粒子则不能通过。这种性质容许混合在一起的液态及固态物质分离。 6.使分离物质在溶剂中的分配较恒定，得到的斑点较圆整。 7.因为人的皮肤表面也有氨基酸，如果直接接触， 会干扰实验。 8.两边缘相靠导致滤纸的厚度不均，溶剂在滤纸上的移动速度不一致，影响实验结果。

9.点样时点完一点应干燥后在滴，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

10.油性笔标记会溶与层析液，影响实验结果。

11.纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，纸层析所用展层溶剂大多由有机溶剂和水组成。其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，将样品在距滤纸一端约2~3cm的某处，该点为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数不同，即不同氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同，所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸不同，氨基酸随流动相移动的速率就不同，结果他们分布在滤纸的不同位置上而形成距原点距离不同的层析点。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用Rf值来表示。