植物组织中叶绿素的提取及分离
一、实验目的
1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；
2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、实验原理
绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过柱层析进行分离。
三、主要仪器与试剂
仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸
试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。
四、实验流程
五、操作步骤
1、菠菜色素的提取
称取2g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。
将菠菜汁放回研钵，每次用10mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用5mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。
2、柱层析
在层析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝（150~160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下1~2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。
将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。
待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。
用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（1）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。
六、注释
（1）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。
七、思考题
1、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？
第二篇：叶绿素的提取分离
华南 师 范 大 学 实 验 报 告
学生姓名 罗玉玲 学 号 20102501014
专 业 生物科学 年级、班级 10科四
课程名称 植物生理学实验 实验项目 植物生理学 第一次实验
实验类型 □验证 □设计 □综合 实验时间 20## 年 11 月 8 日
实验指导老师 叶庆生、冷佳奕 实验评分
叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定
1. 实验目的
1.1学会叶绿体色素提取和分离的方法。
1.2了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
2.实验原理
2.1叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
2.2叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应形成绿色的可溶性叶绿素盐，可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开；在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代，形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素；叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
3.实验器材和试剂
3.1实验仪器与器具
研钵、漏斗、剪刀、、圆形滤纸、分光光度计、电子天平、量筒、移液管、滴管、试管、试管架、酒精灯等
3.2实验试剂
丙酮、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、无水氯化钠、乙醚等
3.3实验材料
勒杜鹃叶片
4.实验步骤
4.1叶绿素提取
取2g勒杜鹃叶片 去掉主脉，剪碎 研磨 圆形滤纸过滤 收集提取液
4.2荧光现象观察
透射光下观察溶液颜色
叶绿素提取液
反色光下观察溶液颜色
4.3光对叶绿素的破坏作用
色素提取液少许等量分装于两试管 一支处于黑暗 、另一支于太阳光下 经2h后观察两支试管的颜色
4.4铜代反应
取一支作为对照
各取色素提取液2ml于两支试管中 取另一支 变褐色后 观察颜色的变化
4.5
皂化反应
取色素提取液10mL于分液漏斗 摇匀 沿漏斗边缘加入30mL蒸馏水 轻轻摇动 静置分层
弃去下层丙酮和水 蒸馏水冲洗乙醚溶液1次
摇动分液漏斗后静止10分钟
摇动后静置 将黄色素与绿色素层分装于2支试管中
4.6色素吸收光谱曲线的观察
将皂化反应得到的两管色素液注入比色杯中，另取超纯水作空白对照 用分光光度计在400~700nm测得色素吸收光谱曲线
5.实验结果
5.1荧光现象观察
色素提取液在钨丝灯直射下，色素溶液的颜色透射光是为绿色反射光时为红黑色。这是由于叶绿素分子不吸收绿光，在透射光下为绿色，而叶绿素受光激发后发射的红色荧光，因此反射光下可见红黑色。
5.2光对叶绿素的破坏作用
图一 提取液在黑暗处理、光照后的实验现象
黑暗处色素溶液颜色没有变化，依然呈现出绿色，如上图左侧试管中的溶液；经太阳光处理后色素溶液颜色变深黑绿色，如上图右侧试管中的溶液。
5.3铜代反应
图二 铜代反应实验过程中观察到的现象
滴加浓HCl后色素色素提取液的颜色变为褐色，加入固体醋酸铜加热后，色素溶液颜色变回绿色
5.4黄色素与绿色素的分离(皂化反应)
图三 乙醚萃取叶绿素结果 图四 黄色素与绿色素的分裂结果
加入20mL乙醚到分液漏斗萃取色素后，色素溶于乙醚中，置于上层,如图三所示；加入5mL30%KOH-甲醇溶液后，叶绿素发生皂化反应，最后黄色素溶于乙醚中，置于上层；叶绿素溶于水中，置于下层，如图四所示。
5.5色素吸收光谱曲线的观察
图五 400~700nm测得色素吸收光谱曲线
在400~700nm测得两大类色素的吸收光谱曲线如图五所示，从图中可知叶绿素有两个吸收高峰，分别为420nm左右、640nm；黄色素的吸收高峰则出现在420nm~460nm。
6.分析与讨论
6.1叶绿素可溶于有机溶剂中，可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等提取，本实验则用了丙酮提取，效果挺好的。
6.2叶绿体中的色素所处的环境具有微碱性，试验中由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具有微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接与叶绿体中的色素接触，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色。而碳酸钙是强碱弱酸盐，在水中的溶解度很小，但还是有一部分溶解后呈弱碱性，中和细胞液的酸性，保护了细胞中的色素。具体是叶绿素分子结构中含有一个镁原子，当细胞破裂时，细胞液内有机酸中的氢离子可取代美原子而成为褐色的去镁叶绿素，碳酸钙中和有机酸的氢离子防止去镁反应的发生。但如果研磨过程中加入过量的碳酸钙则会有大量的碳酸钙不能溶解，影响过滤效果。
6.3分配层析的原理是：利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中的分配系数差异，将它们分裂。在纸层析中流动相是指层析相，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具有亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。在纸层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经色素滤液细线时，滤液细线上的色素就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，最终导致形成不同的带。
6.4离体的叶绿素分子对光很敏感，强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。因此绿色叶子中的叶绿素由于有酶的保护，在光下也不会被破坏。
6.5铜在叶绿素分子中可替代镁，生成铜代叶绿素，此种化合物稳定，颜色鲜艳。因此常常被用在植物标本保存中。经铜代处理的标本，可常年保持绿色。
6.6皂化反应是碱催化下的酯水解反应，尤指油脂的水解。
叶绿素与黄色素的分离实验中，首先用乙醚将色素分子萃取收集，然后加入30%KOH-甲醇溶液，创造碱性环境，使二羧酸酯——叶绿素发生皂化反应，叶绿素分子的酯键水解生成盐溶于水中，而叶黄素则依然溶于乙醚，所以，经过皂化反应后，黄色素溶于乙醚中，置于上层；叶绿素溶于水中，置于下层。