植物叶中色素的提取和柱色谱分离实验报告

一．实验目的

1、学习从植物中提取色素的方法。

2、学习柱色谱(层析)的原理及其操作方法。

3、掌握天然药物化学实验报告的一般写法。

二．实验原理

1、绿色植物叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。各种色素能溶解在有机溶剂（无水乙醇等）中形成溶液，使色素从生物组织中脱离出来。

2、柱色谱是通过色谱柱来实现分离的。在色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)如氧化铝或硅胶。液体样品从柱顶加入，当液体流经吸附剂时，由于吸附剂表面对液体中各组分吸附能力不同而按一定的顺序吸附。然后从柱顶加入洗脱剂(流动相)，样品中的各组分随洗脱剂按一定的顺序从色谱柱下端流出，根据不同颜色分段收集。吸附剂，常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁等。吸附剂对化合物的吸附能力与分子的极性有关，极性越强，吸附能力越大，分子中含有极性较大的基团，其吸附能力也越强。溶剂，溶剂分为溶解样品的溶剂和洗脱剂。选择溶剂时还要考虑到被分离物各组分的极性和溶解度。通常是先将要分离的样品溶于非极性溶剂中，从柱顶加入柱中。然后用稍大极性的溶剂使各组分在柱中形成若干谱带。再用极性更大的溶剂洗脱被吸附的物质。为了提高洗脱效果，有时也使用混合溶剂。在本实验中色素成分在不同比例混合洗脱剂的作用下可以分离出来。

三．实验仪器及试剂

仪器：烧杯、量筒、色谱柱、分液漏斗、玻璃棒 、干燥的锥形瓶、滤纸、旋转蒸发仪 、酸式滴定管、布氏漏斗、研钵、胶头滴管、剪刀、天平

试剂：50g新鲜植物叶、中性氧化铝、甲醇 ( 9 5 ％ ，分 析 纯 ) 、乙醇、石油醚 ( 6 0～ 9 0 ％ ) 、丙酮 、无水硫酸钠 、正丁醇 、50g新鲜植物叶、

四．实验内容

1. 绿叶色素的提取

把新鲜绿叶洗净晾干或用滤纸吸干，称取5g绿叶，剪碎后放入研钵，再加入10mL乙醇。研磨后用布氏漏斗抽滤，弃去滤渣。

将滤液放回研钵，每次用10mL 3:2 （体积比）的石油醚 - 甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。把两次滤液合并，转入分液漏斗中。用5mL水洗涤两次，弃去水-甲醇层,洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。石油醚层转入干燥的锥形瓶中用无水硫酸钠干燥。干燥后的液体在旋转蒸发仪上蒸除石油醚至体积约2mL左右。

2.柱色谱分离色素

取一支干净的酸式滴定管，向柱内加入石油醚至柱高约1/2处。再缓慢加入氧化铝，并打开活塞 ，控制流出速度约为2滴/s ，并保持液面不低于固定相。

打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1－2mm 高时关上活塞。注意，在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面。

色素浓溶液用滴管小心加到色谱柱顶部，并要旋转加入。加完后打开下部活塞，让液面下降到柱面以下1mm左右关闭活塞。旋转加入数滴石油醚，重新打开活塞使液面下降，重复几次使有色物质全部进入柱体内，待色素全部进入柱体后，观察并记录下此时实验的现象。在柱顶小心加洗脱剂—石油醚 - 丙酮溶液 9:1 （体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用试管收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一试管收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。用石油醚 - 丙酮 7:3 （体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素 （1）。再用丁醇 - 乙醇 - 水 3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。

五．实验结论与分析

1、本次实验总共重复了三次，第一次采用的是蚕豆叶，提取的色素浓液很少所以色素带分层现象不明显；第二次采用的是野草的嫩叶，提取出来的主要是淡黄色的色素，叶绿素较少；第三次因为时间关系采用了少量的是莴苣叶比较前两次实验，很遗憾实验分层现象还是不明显。通过不同品种的原材料的选取，以及用量的多少对实验很关键，总的来说还是用适当的过量的绿叶较好，可以避免转移过程中的损失，而且绿叶最好是深绿色的肉质植物。

2、研磨时加入适量的乙醇有助于打开植物细胞壁，有利于色素的流出，第一次采用的是甲醇，第二次是石油醚，第三次是乙醇，实验结果从提取的汁液来看第三次的汁液明显是深绿色，第一次是浅绿，第二次是淡黄色。通过查阅文献和实验比较，提取色素过程中，由于抽滤时不好控制，非极性溶剂难免会被抽去，且在几次转移中损失较多，程序繁杂。用浸泡法操作简便易行，损失少，产率高。因甲醇与乙醇的极性相近，乙醇易得，无毒，用95％乙醇通过浸泡的方法提取菠菜色素为此实验的优化条件 。

3、固定相的选择也是一个影响实验结果的关键，此次试验我们组并未将氧化铝和硅胶两种固定相一起作比较，但从别组两种比较的结果来看，通过比较，中性氧化铝虽用量比硅胶稍大，但其装柱 较容易，只要保持比较均匀的速度从 漏斗中加入，且轻轻敲打柱身，柱内气泡就较少，柱子装的也比较实，色带的分离效果比硅胶明显。使用硅胶做固定相时，虽用量较少，但在装柱过程中，容易 出现大量泡，会影响色带的分离。为消除气泡，采用吸耳球对柱子加压，将气泡挤出柱体。但这种方法容易导致柱子的堵塞，而且在加压过程中，脱脂棉上层的少许沙子常会堵在滴定管的尖嘴处，导致色带分离时溶剂不易滴出，延长了实验时间，还影响了色带分离效果。但采用硅胶做固定相时，第一个胡萝卜素的橙黄色带分离效果很好。同时用两种固定相分离时，叶黄素的黄色色带都分离不够明显，经查阅资料认为叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到 的提 取液中，叶黄素含量很少，所以柱色谱中不易分出黄色带。但比较两者，采用硅胶分离时，黄色色带几乎看不出来。因此采取氧化铝做实验现象更明显。用中性氧化铝作为固定相装柱效果最好。装柱的时候采取干法装柱效果较好。 同时需注意在柱的底部要铺少许的脱脂棉以防止氧化铝堵塞柱子尖嘴处 。装 完柱后还要在柱的顶部铺一层细沙，当溶剂下降到沙层时要及时添加，以防柱 身干裂。色谱柱顶部的氧化铝和沙层注意不要倾斜，如果倾斜会影响色带的分离效果。同时保持2 滴/s 的速度放出溶液(使色带均匀下移)，所加压力不要太大。

六．实验思考

1、植物的绿叶在研磨时不要太烂而成糊状导致不容易分离。

2、叶绿素色素对光，温度，氧气，酸，碱及其它氧化剂都非常敏感，故色素的提取和分离应避光。

3、在洗脱过程中，不要大量放出溶液，以免固定相表面暴露导致柱子干裂。

4、固定相的顶部保持水平，并且柱内应当没有气泡。气泡或倾斜的部会使得流出柱体的化合物的色带易变形。

5、甲醇有毒，请在通风良好处使用；

6、柱中不可有空气，必要时用装在玻棒上的橡皮塞轻轻敲击柱身；

7、柱中硅胶表面任何时候都不得露出液面，以防有空气进入；

8、待色素全部进入柱体后，方可进行洗脱，以防有拖尾影响分离效果。

第二篇：提取叶绿素

实验步骤：

1．叶绿素的提取

▲ 将新鲜菠菜（Spinacia）叶片洗净擦干，去叶柄及叶脉。称取样品8g，剪碎置研

钵内，加入8cm3 丙酮及少许固体碳酸钠，迅速研磨成匀浆；然后再加入20cm3 丙酮充分研磨。 ▲ 在一玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤至已装有20cm3 石油醚

的分液漏斗中，再用少量的丙酮冲洗叶片残渣及研钵，合并滤液。

▲ 沿分液漏斗的壁小心加入40cm3 蒸镏水，轻轻摇动，使色素转移到上面的石油醚层

静置数分钟，待分层清楚后弃去下面的丙酮一一水层。如发生乳化现象可加入2－3cm3 饱和 NaCl 溶液。

▲ 在分液漏中再加入40cm3 蒸镏水，轻轻摇动，以洗去石油醚中残留的丙酮，共洗两

次。然后将叶绿素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用黑纸包好备用。

2．叶绿素理化性质的观察

▲ 光对叶绿素的破坏作用

分别在两支具塞试管中注入2cm3 叶绿素的石油醚提取液，盖紧塞子。一支置暗处，一

支置强光(如太阳光)下，2－3h 后，观察比较两者的变化差异，或在分光光度计的663nm 处 图 17.1 叶绿素分子式

17． 叶绿素的提取及理化性质的鉴定

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比较二者的吸光度值的差异，将结果记录在实验报告中。

▲ 叶绿素的皂化反应

在一支试管中先加入2cm3 叶绿素石油醚提取液，再加入2cm3 新配制的30％ KOH－甲醇 溶液，用力摇动混匀后静置，待分层清楚后观察各层的变化，将观察结果记录在实验报告中。 ▲ 去镁叶绿素的形成

在一支试管中加2cm3 叶绿素石油醚提取液，然后小心加入3cm3 6mol/dm3 HC1，摇动混

匀后静置，待分层后观察各层的变化，记录观察结果。

▲ 铜的取代作用

在一支试管中加入3cm3 叶绿素丙酮提取液，然后加入3cm3 6mol/dm3 HC1，摇匀后再加

入一小块醋酸铜结晶，将试管在水溶中微微加热，观察溶液的颜色变化，记录观察结果。 ▲ 叶绿素的荧光

在一支试管中加入2cm3 叶绿素石油醚提取液，在与入射光(如窗口的自然光)相垂直的

方向观察叶绿素荧光，记录观察结果。

四、方法和步骤

1、叶绿体色素的提取

? 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许 固体碳酸钠或碳酸钙和 10cm 3丙酮，迅速研磨成匀浆，再加 15cm 3丙酮充分研磨提取叶绿素。 ? 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有 15cm 3石油醚的分液漏斗 中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。

? 沿分液漏斗的壁小心加入 30cm 3蒸馏水，轻轻转动加入4 -8cm 3饱和NaCL水溶液，静止几分钟 待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。再加入 30cm 3蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油 醚中残留的丙酮，弃去水层。共洗两次。将色素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用 黑纸包好备用。

2、叶绿素理化性质的观察

? 光对叶绿素的破坏作用，在 2支具塞试管中各放入 2cm 3上述色素石油醚提取液，盖好塞子。一

支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经2—3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变 化，或在分光光度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。

? 叶绿素的荧光，取 2cm 3上述色素的石油醚提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂 直的方向观察叶绿素暗红色的荧光。

? 叶绿素的皂化反应，取 1 -2cm 3上述色素的石油醚提取液一试管中，逐步加入2 -5cm 3新配制的 30% 3KOH-甲醇溶液，用力振动试管后静止分层，观察上下层溶液的变化。

? 去镁叶绿素的形成，取 1 -2cm 3上述石油醚提取液放入试管中，小心加入 3cm 36mol/dm3HCL， 摇动后静止分层观察溶液颜色变化。

? 铜的取代作用，取 1 -2cm 3色素的丙酮提取液于试管中，加入 3cm 36mol/dm3HCL，摇动试管，再逐步加入醋酸铜结晶（把试管放进水浴中微微加热），可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色，说明铜取代了氢占据在镁在叶绿素中的位置。

在实验中加入少许二氧化硅的目的是为了研磨充分。加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用

防止叶绿素的变化

叶绿素是一种天然色素，对光热、酸碱等比较敏感。因此，在加工或贮藏过程中常易褪色或变色，对蔬菜成品感官质量影响巨大。叶绿素的防护：

①碱处理。将蔬菜在0.01%的氢氧化钠等稀碱溶液中浸泡20分钟-30分钟，叶绿素生成叶绿酸盐、叶绿醇等，颜色仍为鲜绿色。但这种方法保绿时间不太长，会导致营养成分的严重损失。

②用铜或锌取代叶绿素中的镁。可选用醋酸铜、硫酸锌溶液，浓度以0.1315%最好，ph值为9，浸泡30分钟。生成铜和锌的衍生物可以长期保持绿色。铜比锌活性高，取代反应速度快，但铜的残留量受质量标准限制，而锌的安全性较高，护绿效果也不差，成本也较低，可优先考虑使用锌制剂来保护蔬菜的绿色。