实验一  血清蛋白电泳(醋酸纤维薄膜法)

[目的]
　　了解电泳法分离蛋白质的原理、操作方法及临床意义。

[原理] 
　　带电荷的蛋白质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在pH7以下，若将血清置于pH8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a₁-球蛋白、a₂-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。
　　醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。

[仪器与材料]   
　 1．仪器：电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。
　 2．材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。

[试剂]
　 1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06)。称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。
　 2．染色液。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸馏水溶解，并稀释至100毫升。
　 3．漂洗液。3%(V／V)醋酸溶液。
　 4．透明液。取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。
　 5．0.4mol／L氢氧化钠溶液。
　 6．40%(V／V)醋酸溶液。

[操作]
　 1．薄膜的准备：取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在毛面的一端约1.5厘米处，用铅笔轻划一直线，表露点样位置并编号。然后将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。
　 2．点样。取少量血清置于普通玻璃板上，用点样器的钢口蘸取血清(约3~5ml)，随后将钢口垂直“印”在点样线上，待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意，要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。
　 3．平衡与电泳。将已点样的薄膜加样面朝下，加样端置于阴极端，平整地贴于电泳槽的支架上拉直。支架上事先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条作的“滤纸桥”(如图2)。平衡数分钟至薄膜重又湿润时方可通电进行电泳。一般电压为120~160伏，电流约0.4~0.6毫安／厘米，通电时间40~50分钟，待电泳区带展开约3.5厘米时断电。
　 4．染色。小心取出薄膜，直接浸于丽春红S染色剂中5~10分钟(以清蛋白区带染透为止)。然后在漂洗液中连续浸洗数次，使薄膜底色漂净，即得五条蛋白色带。从阳极端起依次为清蛋白、a₁、a₂、b和g-球蛋白。   
　 5．透明。若要保存薄膜，待薄膜完全干燥后，置透明液中10～20分钟，取出贴于玻璃板上，干后则透明，可长期保存。
　 6．定量及计算。将漂洗净的薄膜吸干，剪下各蛋白色带，另于空白部位剪一相当于清蛋白宽度的膜条做空白，分别置于0.4mol／L NaOH溶液的试管中，清蛋白管加4毫升，其余各管加2毫升，振摇，使溶液浸没膜条后，置37℃水浴10分钟，使其色泽浸出。再向各管加40%(V／V)醋酸0.4毫升，清蛋白管则加0.4毫升，以中和部分NaOH，使色泽变红色。取各管上清液用分光光度计，在520nm处，以空白管调工作零点后。分别测得清蛋白管、a₁、a₂、b和g-球蛋白各管的吸光度值。  

　　定量计算时，先计算各光密度值的总和：

                  A _T  = 2×A_清+ A _a1 + A _a2 + A _b + A _g

　　再计算血清各部分蛋白质所占的百分率：
　　　　

　　Ax表示各球蛋白组分 (a₁、a₂、b 和 g ) 的吸光度。
　　若条件许可，也可将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析与计算。   
　　血清蛋白醋纤薄膜电泳的参考正常值为：
　　　白蛋白      62～71 %
　　　a₁球蛋白     3～4 %
　　　a₂-球蛋白    6～10 %
　　　b-球蛋白     7～11 %
　　　g-球蛋白      9～18 %

第二篇：EXP-血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳