血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验

一．实验原理

1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。
2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。

3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。

4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。

5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。

6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。

二．实验仪器和试剂

² 器材

      醋酸纤维素薄膜（3×8cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子

²  材料
新鲜血清（未溶血）

² 试剂

1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：

巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。（已配置）

2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏                                 水40ml，混匀。

3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。

   4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。

三．实验过程

一.准备与点样

      1.将薄膜剪成3×8cm的小条，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。

      2.将薄膜无光泽面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。

      3.将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余水分。用毛细管吸取新鲜血清约5ul，涂于厚0.5厘米的载玻片末端，然后轻轻压在划痕处，待血清完全浸入膜内以后移开载玻片。

   

二、电泳

    将点样后的薄膜置于电泳槽支架上，无光泽面朝下，点样末端置于负极。槽架上用四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电，电压110伏，电泳1小时左右关电源。

三、染色和漂洗

   通电完毕后，用镊子将膜取出，直接浸于染色液中2分钟后取出，立即浸泡于漂洗液中，反复漂洗，直至背景漂洗净为止。用滤纸吸干薄膜。

四、定量（洗脱法）

⒈取6支试管，编号，每管加入0.4mol/LNaOH4毫升，剪下薄膜 上各条蛋白色带。另于无色部分剪一大小与色带相仿的薄膜作空白对照。

⒉将各条区带分别放入试管内，不时摇动，待蓝色完全脱下后。在波长650nm处比色。以空白调零，分别读出各蛋白组分的光密度，然后计算出总光密度：

  

   光密度总和T=清蛋清（A)+A1+A2+B+ r各管的0.D。各部分蛋白质的百分数为：

          

清蛋白A=A/T

α1球蛋白= α 1/T

α 2球蛋白= α 2/T

β球蛋白= β /T

γ球蛋白= γ /T

四．注意事项

²  保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。

²  注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不用。

²  加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋白质区带图谱的完美。

²  电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。

²  电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约0.4—0.6mA/cm,电压110—160V，通电时间40—60min。电压高，电流大，电泳速度加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。

²  使用比色皿时要润洗。

²  染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。

²  注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤纸接触了。

²  通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。

五、失败图谱的分析

²  拖尾状            点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。

²  有斑点            点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。

²  边流现象         点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现象。

²  区带模糊         薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。

²  锯齿状            薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。

²  区带倾斜         薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样一边多一边少，区带容易泳斜。

²  显色过浅         点样太少，区带显色不明显。

²  区带重叠          染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。

²  区带过密         电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。

六、思考题

       请你回忆一下你的实验过程，并圆满解释你的结果！

本次实验对细节的要求较高，请大家务必耐心仔细，预祝大家实验成功！·^_^

第二篇：实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白

姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍

学号：12050011012

实验五醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白

   

一、实验目的

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH<PI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离集团不同，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。

       本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。

       血清中含白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等。其等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。

三、实验仪器

1、  牛血清

       2、  醋酸纤维薄膜

       3、  镊子

       4、  电泳仪

       5、  电泳槽

       6、  盖玻片

四、实验试剂

1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。

   2、 染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。

   3、 漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。

五、实验步骤

1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。

   2、点样：取盖玻片一块，用玻璃棒将血清均匀的涂在盖玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3处点样。

   3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。

   4、 染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。

   5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。

   6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。

注意事项：

1、醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面；

2、电泳槽中间为正极，两端为负极；

3、染色液用完后回收到原来的试剂瓶中；

4、漂洗薄膜时，做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。

六、实验结果

电泳结果如下

七、实验分析

1、醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白的原理：

蛋白质是两性电解质。当PH>PI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PH<PI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状的不同，在电场中的迁移速度不同，故可用电泳法将其分离。

2、电泳注意事项：

电泳时需要注意电流和电压的控制，以及电泳时间。根据图谱分析可以估算血清中蛋白质的相对含量。图谱中颜色的深浅和面积大小可以反应血清蛋白质的含量，颜色较深者含量高，面积较大者含量高。

由于电离时间等因素的影响，实验存在一定的误差。

3、生物化学醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素：

1.电泳时间不足

2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长

3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足

4.点样时薄膜上是否存在多余的水分...

4、用醋酸纤维薄膜法可以将血清蛋白质分为哪几个区带

可分5条带，分别为：α1—球蛋白、α2—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白、白蛋白。

可能分子量越小，带电量越高，运动速度越快。而这五种蛋白的分子量不同，带电量也不同，在电泳时的速度有快有慢。

八、思考题

1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？

血清变质：条带数会有偏差。

巴比妥溶液PH不合适：影响电泳速率。

漂洗次数过多或时间过长：看不清楚条带。 

点样没点好浓度不均或者条带模糊。

2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？

点样没有点好，盖玻片要直直的压在薄膜上，否则血清不均匀，影响电泳条带形状；

血清不宜过多，若过多则条带过宽，分离不完全；

也不易过少，过少则条带分离不完全。