实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

【实验目的】

学习醋酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关操作技术。

【实验原理】

本实验以乙酸纤维素薄膜作为血清蛋白电泳的支持介质。血清蛋白分子的大小、形状以及在同一pH下所带电荷的差异将导致它们在电场中的移动速度不同，从而使得它们在膜上能够分离开，染色后呈现出电泳图谱。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见表），在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5 种蛋白质的等电点大部分低于pH值 7.0，所以在缓冲液（pH值8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH 溶液浸洗下来，进行比色测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

测定血清中蛋白质含量有一定的临床意义。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可使白蛋白下降。肾病时 α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

【器材与试剂】

器材：1.电泳仪2.电泳槽3.载玻片（厚约1mm）4.滤纸5.竹镊子6.可见光分光光度计或光密度计7. 乙酸纤维素薄膜（2cm×8cm）8.人血清 （新鲜无溶血现象）

试剂：1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）2.染色液（氨基黑

10B：） 3.漂洗液4.透明液5.浸出液

【实验步骤】

1．准备：取一条大小为 2cm×8cm 的醋酸纤维薄膜（可根据需要选择薄膜的大小），鉴别薄膜的光滑面和非光滑面，并用铅笔作标记，浸入缓冲液中，20分钟后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，薄膜上再放一张干净滤纸，吸去多余的缓冲液。

2．点样：用盖玻片（玻片宽度应小于薄膜）蘸取少量血清，将此血清均匀地涂在距纤维薄膜一端1.5cm 处接触，样品即呈一条状涂于纤维膜上。待血清透入膜内，移去载玻片。

3．电泳：将薄膜平贴于已放在电泳槽上、点样面朝下，光面朝上，点样端为阴极。调电压100—120V或电流0.4---0.6 mA/cm，时间为45分钟。

4．染色：将薄膜浸于染色液氨基黑10B中 3～5 分钟，取出，用漂洗液漂至背景无色（约4～5 次），再浸于蒸馏水中。

5、定量：剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜，分别浸于4.0ml 0.4mol/L NaOH37℃水浴 5～10 分钟，色泽浸出后，用 722 分光光度计在 590nm处比色，以空白膜条洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。

6.观察结果

【实验结果】

1.依据所给的参数，分析哪种蛋白质电泳的距离最远，哪种蛋白质色带最深

复习思考题、作业题： 1.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？

2.用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？

第二篇：实验三 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白

                      山东大学实验报告              20##年3月27日

姓名 张行润      系年级 2009级生科4班     学号 200900140177       同组者 于潜

科目 生物化学实验     题目 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白        仪器编号 105

一、    实验目的

掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。

二、    实验原理

蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

三、    实验器材

1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）

2、人血清；

3、烧杯及培养皿 数只；

4、点样器；

5、竹镊子；

6、玻璃棒；

7、电吹风；

8、试管 六只；

9、恒温水浴锅；

10、电泳槽；

11、直流稳压电泳仪；

12、剪刀

四、    实验试剂

1.   电极缓冲液

2.   染色液（可重复使用，使用后回收）

3.   漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml。

4.   透明液（20ml每组）：无水乙醇：冰醋酸=7：3。

5.   健康人血清（新鲜，无溶血现象）。

6.   巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；

五、    实验步骤

⒈  薄膜浸泡：

提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；

⒉  电泳仪检查：

水平检查，电源检查；

⒊  电泳槽的准备：

在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折，翻过来，用电极缓冲液完全浸湿，架在电泳槽的四个膜支架上，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。

⒋  点样：

取新鲜血清于载玻片上，将盖玻片掰呈适宜大小，使一边小于薄膜宽度。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出，用滤纸吸去表面多余的液体，然后平铺在滤纸上，将盖玻片在血清中轻轻划一下，再在膜条一端1.5~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起，即在膜条上点上了细条状的血清样品，呈淡黄色。

⒌  电泳：

用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路，调节电压到90V，预电泳10min，再调电压至110V，电泳时间50min～1h。

⒍  染色：

将染液倒入大培养皿中，电泳完毕立即用镊子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色9min，然后取出。

⒎  漂洗：

配制好漂洗液，将染色完毕的薄膜自染液中取出，直接放入漂洗液中，连续更换几次漂洗液，直到薄膜背景几乎无色为止。

⒏  透明：

配制好透明液，用镊子将薄膜取出，贴在容器壁上（烧杯壁或培养皿上等），注意不可有气泡，用吹风机稍吹干薄膜，用胶头滴管淋洗薄膜，将每组20ml透明液淋洗玩即可，再用吹风机将薄膜彻底吹干，此时薄膜透明，小心将薄膜自容器壁上取下。

六、注意事项

1.        点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。

2.        两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面，否则会因虹吸影响电泳效果。

3.        醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。

七、实验结果

    染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。下面是通过本次实验获得的一条电泳带：

八、结果分析

本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好，主要的问题有以下几个：

1.   有些电泳带参差不齐；

2.   个别电泳带的两条带之间界限不明显；

分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点：

1.   将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜；

2.   用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中，薄膜可能受到了异物污染；

3.   缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨；

4.   电流强度控制的不好，因为电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；

5.   染色时间控制不合适。因为时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均；

6.   透明时间控制不合适，如在透明液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。