实验一 凝集试验
颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。
[目的要求]
1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]
1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）试管凝集试验
以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。
4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）
弃1.5 弃0.5
5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。
＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。
牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。
[注意事项]
1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。
2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验
1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100mL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80mL、第2格40mL、第3格20mL、第4格10mL。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。
大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40mL 和20mL ；猪、山羊、绵羊、狗用80mL和40mL。
2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。
抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。
3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。
4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。
5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。
＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。
＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。
＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。
＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。
－：液体均匀混浊，无凝集现象。
6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。
表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系
7. 判定标准：同试管凝集试验。
8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。
（三）虎红平板凝集试验
这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。
1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30mL滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。
2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。
3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。
（四）鸡白痢平板凝集试验
1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30mL）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。
2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
[思考题]
1. 凝集反应的原理是什么?
2. 哪些因素影响细菌凝集试验?
3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？
实验二 病毒的血凝及血凝抑制试验
有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50mL定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50mL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50mL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50mL；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50mL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：mL）
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50mL，吹吸混合均匀，吸50mL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50mL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50mL，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50mL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50mL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）
6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
附 录
1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
枸橼酸钠（5H2O） 0.80g
枸橼酸（H2O） 0.055g
葡萄糖 2.05g
氯化钠 0.42g
双蒸水 加至 100 ml
将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。
2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。
[思考题]
1. HA和HI试验的原理是什么？
2. HI试验是不是特异的抗原抗体反应，为什么?
3. HA和HI试验有何实际应用意义？
第二篇：免疫学实验指导书
免疫学实验指导
刘佳斌编
生命科学学院
生物技术系
2005.3
实验1
动物的注射采血及血清制备
家兔采血有耳静脉采血，耳动脉放血，心脏采血和劲动脉放血法，耳缘静脉采血一般适用于只需少量血液，常用于免疫注射采少量血，测其效价，心脏采血和耳动脉采血法，耳缘静脉采血一般只适用少量采血。常用于免疫注射采少量血，测其效价。心脏采血和耳缘动脉采血可采大量血有能保存动物，从动脉可采大量，动物死去。兔一般采血20ML不影响其存活。
鸡一般用心脏采血法，每只鸡一次取血20ML，不影响其存活，经3—6个月后，可再次采血。注射途径一般有皮下、静脉、皮内和腹腔。
一、目的与内容：
(一)目的
1.学习动物不同部位的采血方法
2.练习对家兔耳静脉的注射方法
3.用离心法制备血清
(二)内容
1、鸡心脏采血
2、家兔采血
3、制备血清
二、材料与用品
(一)材料
兔、鸡
(二)用品
生理盐水、注射器、剪刀、镊子、试管、离心管、离心机
三、操作与观察
(一)鸡心脏采血
1、固定鸡腿、翅膀，拔取心脏部位羽毛，用手将鸡按定。
2、寻找内肋骨到肩胛部皮下静脉，心脏在此静脉分支下面，以食指触摸心跳，消毒，垂直刺入针头，如触及肋骨则稍后退，将针头稍后偏于胸骨，切不可硬往里插，针头向里刺入后，可感到心脏跳动。此时，针头刺入心脏，徐徐抽取血液。采血20ML取下针头，将血液放入离心管。
(二)家兔采血
1、家兔心脏采血
（1）固定兔，剪取左前胸心脏部位的毛，酒精棉球消毒皮肤。
（2）用左手食指、中指、无名指防在右胸处，轻轻向左推，将心脏推至左恻固定，拇指在胸左恻由下向上数至第三至四肋骨探测心脏搏动最剧烈处
（3）将针头从搏动处刺入心脏，若准确徐徐抽取血液，足量后拔除，再改变方向成径直刺入心脏，取血液20ML，放入离心管。
（4）家兔静脉注射，在耳缘静脉注入1ML生理盐水。
2、家兔耳缘静脉采血。
(三)制备血清
四、作业与思考
1、心脏采血关键什么？需要注意哪些问题？
2、抓兔子时为什么不能抓它的双耳？正确的抓取方法是什么？
实验2
抗原与免疫血清的制备
将抗原注射入动物体内，刺激动物的B淋巴细胞转化为浆细胞，产生特异性抗体。待其血清中累积大量抗体时，采其血液分离血清，即抗体的免疫血清。抗原量低到一定程度时，抗体不能产生或用现有方法不能测出，但超过最高限度，又对抗体产生抑制作用。本实验抗原为细菌细胞，采用每毫升含9亿个细菌比较恰当。
一、目的与内容
(一)目的
1、抗原与抗体的制备方法
2、为凝集实验制备材料
(二)内容
1、抗原的制备
2、免疫血清的制备
二、材料与用品
(一)材料
大肠杆菌，家兔
(二)用品
麦氏比浊管，试管，注射器，9号、7号针头，离心机等
0.5%的石炭酸生理盐水
三、操作与观察
（一）抗原的制备
（1） 取5ML0.5%的石炭酸生理盐水，注射大肠杆菌斜面，洗下菌台
（2） 用无菌毛细菌滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管
（3） 将此含有菌液的小试管放60度水浴箱中1小时，并不时摇动。
（4） 取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石炭酸生理盐水４ml（或更多，是原菌液浓度而定），混匀后各比浊管比浊。
麦氏比浊法原理：某一未知菌浓度，菌液在投射光作用下用肉眼与某一比浊管比较，如果二者透光度相同，即可目测该菌大致浓度。
（5）稀释：用0.5％的生理盐水，待菌液稀释9亿／ｍｌ，即等浊于第3支。
（二）免疫血清的制备
（1）注射动物：耳缘静脉注射抗原。
（2）14日采血1ｍｌ，分离血清，测其效价，合格即大量采血。
（3）心脏采血
（4）分离免疫血清。
四、作业与思考
１．在动物体内制备免疫血清为何要多次注射？
２．制备大肠杆菌抗原时，使用石炭酸生理盐水和加热６０℃1ｈ的目的是什么？
实验3
环状沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体反应，在有电解质的情况下，会产生细微的沉淀，称为沉淀反应。环状沉淀反应是使抗原抗体在沉淀管内形成交界面，然后在此交界面处出现—环状乳白色沉淀物，出现此环状反应的抗原最高峰，稀释度为沉淀素效价。
一、目的与内容
(一)目的
通过沉淀素的效价测定，学习环状沉淀反应的操作方法及结果观察。
(二)内容
鸡血清与免抗鸡免疫血清发生沉淀反应。
二、材料与用品
(一)材料
鸡血清、兔血清、免抗鸡免疫血清
(二)用品
小试管、1ml吸管量筒、生理盐水
三、操作与观察
1.将鸡血清以1：25稀释，去该液1ml，用倍比稀释法稀释为各种浓度（1#1*、2# 2*……）分别表示自第1管、第2管中吸取1ml以此类推。）
2.将9个干洁小试管插在试管架上，使直立。
3.用吸管吸取1：2的免抗鸡免疫血清，加入小试管底部，每管约两滴。
4.用另一吸管吸取上面稀释的鸡血清（抗原），按下表加入各管。
从最高峰稀释度加起，加入时沿壁徐徐加入，使与下层免抗鸡免疫血清之间形成界面，切勿摇动。
5.室温静置15—30分钟，观察试管中的两液面交界处，有无白色沉淀出现。
6.结果记录：由白色沉淀“+”，无沉淀“—”，出现沉淀最大稀释度的试管其稀释度倒数为沉淀素效价。
四、作业与思考
1.结果：
该沉淀素效价为
2.试验时为何稀释抗原，而不稀释抗体？
实验4
玻片凝集反应
细菌细胞成红细胞颗粒抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可以看见的凝集块，称为凝集反应。玻片凝集法主要利用抗血清来鉴定未知菌，也可用来显示免疫血清的存在，这是一种定性方法。
一、目的与内容
(一)目的
1.了解血清学反应的基本原则。
2.学习玻片凝集现象。
3.观察凝集现象。
(二)内容
兔抗血清与与大肠杆菌发生凝集反应。
二、材料与用品
(一)材料
大肠杆菌、注射大肠杆菌抗原后的家兔
(二)用品
琼脂斜面、培养物、生理盐水、玻片、接种环、血清
三、操作与观察
1.采集家兔血液10ml，离心，制备抗血清。
2.以1：10用生理盐水稀释抗血清。
3.在玻片一端用小滴管加1 滴1：10抗血清，另一端加1滴生理盐水。
4.挑取少许细菌混入生理盐水中，再搅匀，挑取少许细菌混入血清，搅匀。
5.将玻片略微摆动后，静置室温中，1—3 分钟后观察一端是否有凝集反应出现，另一端为生理盐水对照，仍未均匀混合。
四、作业与思考
1.结果
2. 是否出现凝集反应，如没有分析原因？
3.为何采用生理盐水稀释血清，而不用蒸馏水？