【实验题目】
细胞凝集反应
【实验目的】
1、了解细胞的表面结构。
2、掌握细胞凝集的原理。
3、掌握细胞凝集实验的操作方法。
【实验材料与用品】
1. 试剂：PBS缓冲溶液、0.9%的氯化钠溶液（生理盐水）
2. 器具：酒精棉球、双凹片、载玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管
3. 材料：兔子静脉血
【实验原理】
1. 凝集素
凝集素（lectin）是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物、人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。常用的为植物凝集素，通常以其被提取的植物命名，凝集素为它们的总称。
在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（糖萼）。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
2. 细胞凝集
细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团，目前认为，细胞间的联系、细胞的生长和分化、肿瘤的发生与免疫反应都与细胞表面的分枝状糖分子有关。
3. 细胞凝集的反应技术
（1）直接凝集反应技术
颗粒性抗原与相应的抗体血清混合后，在电解质的参与下，经过一定时间，抗原抗体凝集成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素。抗原称为凝集原。细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（阴电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原和抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，称为抗原抗体复合物，由于抗体与抗原结合，降低了抗原分子间的排斥力，抗原表面的亲水基团减少，此时已有凝集趋势，在电解质参与下，中和了抗原抗体复合物的大部分电荷，使之失去了经典排斥力，分子间相互吸引，凝集成较大颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。
（2）间接凝集反应技术
可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质的参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应技术。
4. 载体
具有吸附抗原（抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。
良好的载体有以下几点基本要求：
（1）在生理盐水或缓冲液中无自凝现象；
（2）大小均匀；
（3）比重与介质相似，短时间内不沉淀；
（4）无化学或血清学活性；
（5）吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性；
目前使用最广泛的是人的O型红血球和绵羊红血球。后者使用更广，因其来源方便，另外绵羊红血球的表面有大量的糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。
【实验步骤】
一、大体流程
二、具体操作
1、称取土豆去皮块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗提液中即含有可溶性
土豆凝集素。（老师已做好）
2、抽取兔子静脉血液（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5min，重复3次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%红细胞悬液。
3、分别用滴管吸取土豆凝集素和1%红细胞悬液各一滴，置双凹片左孔内，充分混匀。
4、同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，做对照实验。
5、摇晃5—10min后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。
【实验结果与分析】
I.如图1、图2所示：刚开始计时时，两侧溶液均无凝集现象；4min左右时，可看到双凹片左侧溶液中出现凝集现象，一部分血细胞在中央聚集呈沙粒状，溶液周围较澄清；而右侧溶液无凝集现象。说明土豆凝集素可以使血液发生凝集，而PBS缓冲液则不能。
图1: 刚开始时双凹片两侧溶液对比图 图2：4min时双凹片两侧溶液对比图
II.如图3、图4所示：在10×10显微镜下观察，可看到左侧溶液中血细胞聚集，凝结成块状，而右侧溶液中血细胞分散均匀，呈透明状。
图3: （10×10）显微镜下观察图（左侧） 图4：（10×10）显微镜下观察图（右侧）
III. 在高倍镜下观察如图5所示，可较清楚的看到血细胞聚集在一起，还可看到少数未发生凝集的血细胞；
由以上的观察可知：细胞凝集的时间较快，4min左右就可以发生明显凝集现象；细胞凝集的时间也受到土豆凝集素的浓度，以及血细胞的浓度影响，一般来说，凝集素的浓度越高，血细胞的浓度越高，细胞凝集的时间也会越短，凝集现象也越明显，但在本次实验中未进行不同浓度对凝集时间的影响的实验； 从空白对照还可以看出，细胞发生凝集时凝集素必不可少的，没有细胞凝集素，细胞几乎不发生凝集。
实验反思：
第一次滴加完溶液后，在晃动双凹片的过程中因操作不熟练，使两个孔中的液体混到了一起，因此重新滴加了一次；在使用双凹片时要注意摇动的技巧，不可前后或左右单一地摇动，应该一手固定，一手成环形方向摇动，使凹槽内的液体转动起来，同时注意滴加的液体不宜过多，若加多了可用吸水纸吸掉部分多余液体，避免两个凹槽内的液体相互接触；
【注意事项】
1. 实验前确定好双凹片的反正面，做好适当标记 ；
2. 注意控制加入双凹片孔中的液体的量，以免使双凹片的2个孔中的液体混合；
3. 摇晃双凹片时要注意摇动的技巧，不可前后或左右单一地摇动，应该一手固定，一手成环形方向摇动，使凹槽内的液体转动起来；
4. 显微镜下观察时，注意淀粉球和细胞的区分；淀粉球呈白色球状，略大于细胞；
5. 实验过程中若凹槽内的水分蒸发过多，应及时补充PBS缓冲液，以免观察不到实验现象；
6. 换用高倍镜下观察时，注意避免污染镜头，若液体过多，应用吸水纸吸取部分液体在进行高倍镜下的观察；
第二篇：直接凝集反应实验报告
免疫学·直接凝集反应实验报告
实验一：玻片凝集实验
1.实验原理：
颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应的抗体结合，在适量电解质（通常是0.85%NaCl）存在的条件下出现凝集现象，称为凝集反应。凝集反应的方法有两种：①直接法；②间接法。颗粒性抗原（如完整的细菌或细胞）与相应抗体在体外直接结合而出现的凝集反应，称为直接凝集反应。如玻片凝集反应和试管凝集反应。将可溶性抗原预先吸附于一种与免疫无关的颗粒性载体表面，然后与相应的抗体结合，出现凝集现象，称为间接凝集反应。如RF因子检测
玻片凝集试验是使用已知抗体与未知颗粒性抗原在玻片上直接结合而出现的凝集反应。此类反应较简单迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。
本次实验使用玻片凝集试验的原理进行人类ABO血型的鉴定。ABO血型系统是按照血液中红细胞表面的抗原分子来命名的。人类ABO血型抗原有两种：A抗原和B抗原。A型血红细胞表面具有A型抗原，血液中具有抗B抗体；B型血红细胞表面具有B型抗原，血液中具有抗A抗体；AB型血红细胞表面具有A抗原和B抗原，血液中不具有抗A、B抗体；O型血红细胞表面不具有A、B抗体，但血液中含有抗A、B抗体。若用已知的抗A血清和抗B血清与受试者红细胞上的相应抗原结合，即可引起红细胞凝集，根据凝集反应结果便可判断出受试者的血型。
2.实验方法：
（1）取洁净载玻片一张，用马克笔分为两格并注明A、B分区。
（2）倒置标准抗血清试剂瓶，悬空轻挤出抗A血清一滴，滴在A区内；同法在B区内滴加抗B血清一滴。
（3）使用消毒液对左手无名指进行消毒，待消毒液自然干燥后，使用无菌三棱采血针快速刺破手指。
（4）用木棒的两端取血，分别在抗A血清和抗B血清中搅拌均匀。
（5）用无菌棉棒压迫手指止血。
（6）静置玻片数分钟后，观察红细胞凝集反应结果。
3.实验结果：
4.结果分析：
实验二：试管凝集实验
1.实验原理：
试管凝集反应是在试管内将待检血清对倍稀释后，加入等量的已知颗粒性抗原与待检血清混合，然后观察试管内有无凝集快出现。如出现凝集块者为阳性反应。混合后仍均匀浑浊，无凝集块出现者为阴性反应。根据血清凝集效价判定待检血清中相应抗体的含量。即在试管内用已知颗粒性抗原检测未知抗体的相对含量的半定量试验。本次实验是以定量的伤寒杆菌为抗原，根据是否发生凝集反
应来检测血清中是否含有对应的抗体；根据各试管凝集程度的不同，来判断抗体的效价。
2.实验方法：
（1）取试管6支，用马克笔进行标记，依次放入试管架中。
（2）在第一支试管中加入生理盐水0.9ml，其余各管加生理盐水0.5ml。然后在第一只试管中加入伤寒免疫血清0.1ml，用吸管将它与生理盐水吹打混匀后，取出0.5ml加入第二支试管中；再将第二只试管的液体吹打混匀，取出0.5ml加入到第三支试管中，其余各管依次按照上述步骤将血清对倍稀释。至第五支试管时，将试剂混匀后，取出0.5ml弃之不用。是第六支试管不含伤寒免疫血清，作为实验的阴性对照管。最后在各管中都加入0.5ml伤寒杆菌菌液。
（3）轻摇试管架，混匀试管内液体，56℃水浴1小时后，观察实验结果。
3.实验结果：
（1）对照组：即第六支试管，上清液浑浊，管底可有沉淀的细菌，轻摇后分散呈均匀浑浊。
（2）实验组：按1-5管依次观察。阳性者管底出现不规则凝集物，较松散。阴性者与对照组相同。
（3）凝集程度：
++++：液体澄清透明，细菌全部凝集于管底，轻摇可见大的凝集块。 +++：液体稍浑，细菌大多数凝集于管底，摇动后凝块较前者小。 ++：液体中等混浊，液体中有明显的凝集物，凝集块较小。 +：液体混浊，仔细观察可以看见液体中有很小的凝集颗粒。 -：与对照管相同。
（4）凝集效价：出现明显可见凝集物（++）时的血清最高稀释度为血清效价。