实验一  糖和蛋白质的理化性质检验

（4学时）

第一部分  蛋白质的理化性质

第一节  蛋白质的颜色反应

一、实验目的

掌握鉴定蛋白质的原理和方法。

二、实验原理

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。

三、实验器材与试剂

实验器材

1. 鸡蛋1个

2. 吸管1.0mL（×1）

3. 试管 １.5cm×15cm（×2）

4. 试管架

5. 试管夹2个

6. PH试纸（5-7）

7. 水浴锅

实验试剂

1.   卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。

2.   1%茚三酮溶液： 1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。

3.   浓硝酸： 比重1.42。

4.   10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。

四、实验方法

A. 黄色反应

蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：

操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10％NaOH溶液20滴，观察颜色变化。

B. 茚三酮反应

蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及ａ-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。

操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。

注意：此反应必须在pH5－7进行。

C.双缩脲反应（参考实验）

将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：

操作方法：

1.   取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10％NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1％硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。

2.   另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及１％硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)₂。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu(NH₃)₄^2＋，妨碍此颜色反应的观察。

第二节  蛋白质的沉淀反应

一、实验目的

1.   熟悉蛋白质的沉淀反应。

2.   进一步掌握蛋白质的有关性质。

二、实验原理

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.   试管 1.5cm×15cm（×5）。

2.   吸管5.0ｍL（×2），2.0ｍL（×3），1.0ｍL（×1）。

3.   玻璃漏斗Φ5cm 1个。

4.   滤纸Φ9cm1张。

实验试剂

1.   蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。

2.   硫酸铵晶体： 如颗粒太大，最好研碎。

3.   饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ｍL加硫酸铵至饱和（硫酸的饱和度：707g/1000mL）。

4.   95％乙醇。

5.   结晶氯化钠。

6.   1%醋酸溶液：冰醋酸1ｍL用蒸馏水稀释至100ｍL。

7.   5％鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ｍL。

四、实验方法

A. 蛋白质盐析作用

向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。

操作方法：

1.   取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50％饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。

2.   将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约0.8g），至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

注意： (1)   应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；

(2)   固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。

B. 乙醇沉淀蛋白质

乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。

操作方法：取蛋白质溶液1ｍL，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95％乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。

C. 生物碱试剂沉淀蛋白质

植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。

操作方法：取1支试管，加入2ｍL蛋白质溶液及1％醋酸溶液4-5滴，向一管中加5％鞣酸溶液5~8滴，观察结果。

D.重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）

蛋白质与重金属离子（如Cu^2＋,Ag^＋，Ｈg^2＋等）结合成不溶性盐类而沉淀。

操作方法：取试管2支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加１％醋酸铅溶液，另一管内滴加 1%CuSO₄溶液，至有沉淀生成。

第二部分  糖的理化性质

第一节  糖的颜色反应

A. 莫氏试验

一、实验目的

掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。

二、实验原理

糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.   棉花或滤纸。

2.   吸管 1.0ｍL（×4）、 2.0ｍL（×1）。

3.   试管1.5cm×15cm（×4）。

4.   水浴锅

实验试剂

1.   莫氏试剂： 称取ａ-萘酚5g，溶于95％乙醇并稀释至100ｍL。 此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。

2.   1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ｍL。

3.   1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ｍL。

4.   1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物， 然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。

5.   浓硫酸

四、实验方法

于4支试管中，分别加入1mL 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1mL水中），然后各加莫氏试剂２滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸1.5mL（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。

注意：

1. 一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。

2. 亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替ａ-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。

3. 莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环 。

B. 杜氏试验

一、实验目的

掌握杜氏（Tollen）试验鉴定戊糖的原理和方法。

二、实验原理

戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。戊糖反应最快，通常在45s内即产生红色沉淀。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.   吸管 1.0mL（×1）

2.   试管 1.5cm×15cm （×3）

3.   水浴锅。

实验试剂

1.   杜氏试剂：1%间苯三酚乙醇溶液（2 g间苯三酚溶于100mL95％乙醇中） 3mL，缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。

2.   1%阿拉伯糖溶液： 称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。

3.   1%葡萄糖溶液：见试验A。

4.   1%半乳糖溶液： 称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。

四、实验方法

于3支试管中各加入杜氏试剂1mL，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化并记录颜色变化时间。

C. 塞氏试验 （参考实验）

一、实验目的

掌握塞氏(Seliwanoff)试验鉴定酮糖的原理和方法。

二、实验原理

酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5一羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应； 有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。以糖为例，其反应如下。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.   移液管 0.5mL（×3），5.0mL（×1）

2.   试管1.5cm×15 cm（×3）。

3.   水浴锅。

实验试剂

1.   塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中（V（H₂O）:V（HCl）＝2:1），临用时配制。

2.   1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

3.   1%葡萄糖溶液：见试验A。

4.   1%蔗糖溶液：见试验A。

四、实验方法

于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、 1%蔗糖溶液和 1%果糖溶液各0.5mL，各加塞氏试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。

注意：①在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。

第二节 糖的还原作用

一、实验目的

掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。

二、实验原理

费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu^2＋的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu₂O（由于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。）此法常用作还原糖的定性或定量测定。 其反应表示如下：

 

目前临床上多用本尼迪特法，此法具有如下优点：①试剂稳定，不需临用时配制；②不因氯仿的存在而被干扰；③肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.   移液管 1.0mL（×3）、 2.0mL（×１）。

2.   试管1.5cm×15cm （×3）。

3.   水浴锅。

4.   试管架。

实验试剂

1.   本尼迪特试剂：

称取 85g柠檬酸钠 （Na₃C₆H₃O₇·11H₂O）及50g无水碳酸钠，溶解于400mL蒸馏水中。另溶解8.5g硫酸铜于50mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。

2.   费林试剂 （参考实验）

试剂A：称取硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）34.5g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。

试剂B：称取氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。

临用时将试剂A与试剂B等体积混合。

3.   1％淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。

4.   1％蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

5.   1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

四、实验方法

取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL， 然后每管加本尼迪特试剂2mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。

另于3支试管中加人费林试剂A和B各１mL，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化（此为参考实验，本实验不做）。

五、实验报告

1.   内容与要求：实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。

2.   思考题

（1）双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么？

（2）什么叫蛋白质的变性？盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应，哪些是不可逆反应？

（3）莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖？

（4）比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同？

第二篇：蔗糖的转化

物理化学实验报告

实验名称：  蔗糖的转化

学    号： 

班    级： 

姓    名： 

实验日期： 

一、实验目的

1. 利用物理分析法（借旋光度改变）测定蔗糖水解反应速率常数k及半衰期t_1/2。

2. 掌握影响反应速率与反应速率常数的诸多因素。

3. 熟悉旋光仪的基本原理及使用方法。

二、实验原理

蔗糖水解反应的计量方程式为：

C₁₂H₂₂O₁₁+H₂O ==== C₆H₁₂O₆  +  C₆H₁₂O₆                                             

蔗糖葡萄糖果糖

蔗糖水解速率极慢，在酸性介质中反应速率大大加快，故H₃O+为催化剂。反应中，H₂O是大量的，反应前后与溶质浓度相比，看成它的浓度不变，故蔗糖水解反应可看做一级反应。其动力学方程式如下：

－=K₁C                  积分式为：ln=K₁t                           

 ∴ K₁ =ln或 K=lg　反应的半衰期= （1）

K₁：速率常数t：时间Co：蔗糖初始浓度C：蔗糖在t时刻的浓度

可见一级反应的半衰期只决定于反应速率常数K，而与反应物起始浓度无关。若测得反应在不同时刻时蔗糖的浓度，代入上述动力学的公式中，即可求出K和。

测定反应物在不同时刻浓度可用化学法和物理法，本实验采用物理法即测定反应系统旋光度的变化。蔗糖及其水解产物均为旋光性物质，蔗糖是右旋的，但水解后的混合物葡萄糖和果糖则为左旋，这是因为左旋的果糖比右旋的葡萄糖旋光度稍大的缘故。因此，当蔗糖开始水解后，随着时间增长，溶液的右旋光度渐小，逐渐变为左旋，即随着蔗糖浓度减小，溶渡的旋光度在改变。因此，借助反应系统旋光度的测定，可以测定蔗糖水解的速率。

所谓旋光度，指一束偏振光，通过有旋光性物质的溶液时，使偏振光振动面旋转某一角度的性质。其旋转角度称为旋光度（）。使偏振光按顺时针方向旋转的物质称为右旋物质，为正值，反之称为左旋物质，为负值。物质的旋光度，除决定于物质本性外，还与温度、浓度、液层厚度、光源波长等因素有关。当蔗糖水解反应进行时，右旋角度不断减小，当反应终了时，系统经过零度变为左旋。蔗糖水解反应中，反应物与生成物都具有旋光性，旋光度与浓度成正比，且溶液的旋光度为各组成旋光度之和（有加和性）。

当反应进行到某一时刻，体系的旋光度进过零点，然后左旋角不断增加。当蔗糖完全转化时，左旋角达到最大值_∞。设蔗糖尚未转化时，体系最初的旋光度为₀=K_反C₀，体系最终的旋光度为_∞=K_生C₀。K_反，K_生分别为反应物与生成物的比例系数，C₀为反应物的初始浓度，也是生成物的最后浓度，当反应时间为t,蔗糖的浓度为C，旋光度为t。

t=K_反C+K_生(C₀-C)。

C₀=C_∞=K（₀-_∞），C-C_∞=K（_t-_∞）

C₀=K（₀-_∞），C=K（_t-_∞）

==k₁t

若以ln（a_t- a_∝）～t作图，得一直线，由直线斜率可求出速率常数k₁。根据（1）式可求反应的半衰期。

三、实验仪器和试剂

实验仪器：旋光仪，停表，恒温水浴一套，移液管（50mL），磨口锥形瓶（100mL），烧杯（100mL），台秤，洗耳球。

实验试剂：蔗糖（A.R），盐酸（3mol·L^-1,，A.R）。

四、实验步骤

一、旋光仪的校正

1、了解和熟悉旋光仪的构造和使用方法。

2、开启水浴恒温的电源开关，并将水浴温度槽的温度控制在60℃。

3、旋光仪零点的校正蒸馏水为非旋光物质，可用它校正仪器的零点。将旋光管的一端盖子旋紧，由其另一端加入蒸馏水，然后旋紧套盖，但不要过紧，以不漏水为准。如果管中有气泡，可将气泡导入旋光管粗肚部分。用滤纸将旋光管外部擦干。旋光管两端的玻璃片可用镜头纸擦净。打开光源，把旋光管放入旋光仪内，调整目镜焦距使视野清楚。然后旋转检偏镜至视野中所观察到明暗相等的三分视野为止。记下检偏镜之旋转角，重复几次，取平均值。此值为仪器的零点。

二、测定

1、配制蔗糖溶液：用天平称取10g蔗糖放入烧杯内，加少量蒸馏水溶解后转移到50mL容量瓶中，稀释至刻度。

2、旋光度的测定：将50mL配置好的蔗糖溶液，置于干净的锥形瓶中，再用50mL移液管吸取3moL·L^-1HCL注入蔗糖溶液中。当盐酸溶液流出一半时，开始计时（作为反应开始的时间）。HCL全加入后混合均匀，迅速用少量的混合溶液洗旋光管两次，然后将反应液加入旋光管内，测量各时间的旋光度（操作必须迅速），先记录时间，再度旋光度。

反应开始时，反应速录较快，前15分钟每两分钟测一次，以后反应速率变慢，每次测量的时间间隔适当延长10分钟，从而反应大约连续测量100分钟（1小时后15分钟测一次）。

3、_∞的测定

在上述测定开始后同时将装有所剩余反应混合液的磨口锥形瓶放在50~60 ℃的水浴中反应0.5~1小时。然后冷却至试验温度，则其旋光度即为_∞水浴温度不可过高，锥形瓶不要浸的太深，要盖好瓶塞。试验结束后洗净样品管。

五、数据记录与处理

实验温度：25.5 ℃      盐酸浓度：2 mol.L^-1_∞：-2.60

以上数据以lg（_t-_∞）为纵坐标，以t为横坐标作图，从而算出k

由图可以得：k= -0.013

反应的半衰期：=ln2/k=0.6931/0.013=53.32 min

六、实验讨论

1、实验中所测的旋光度_t为什么不必零点校正？

答：主要是因为蒸馏水没有旋光性，其旋光度为零，其次是因为它无色透明，方便可得，化学性质较为稳定。蔗糖溶液以蒸馏水作溶剂，蔗糖转化反应过程中，无须再作零点校正，因都以蒸馏水作校正，只需校正一次。

2、蔗糖为什么可用上粗天平称量?

答：蔗糖水解为一级反应,反应物起始浓度不影响反应速度常数，又因为蔗糖浓度大用量较多，量值的有效数字位数较多，故不需要精确称量，只要用上粗天平称量就可以了。