电子显微镜生物标本的制备及观察

【实验目的】

了解电子显微镜的基本原理及电镜生物标本的制备方法和观察。

【实验原理】

电子显微镜是细胞生物学研究的重要工具，它以电子束为照明源，利用电子流具有波动的性质，在电磁场的作用下，电子改变前进轨迹，产生偏转、聚焦，因而电子束透过标本后在电磁透镜的作用下可放大成像。高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率远比光镜高，可达0.14nm，放大倍率可达80万倍。由热阴极发射的电子在20～100千伏加速电压作用下，经聚焦后投射到很薄的标本上，并与标本中各种原子的核外电子发生碰撞，造成电子散射，在细胞质量和密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗。在质量、密度较小处电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。

【仪器、材料与试剂】

器材和仪器 Hitachi透射电子显微镜、超薄切片机、恒温箱、400目铜网等。 材料和标本 组织标本均由老师提供。

试剂 2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制)、1％锇酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、环氧树脂包埋剂、柠檬酸铅染液、双蒸水。

【实验内容】

透射电镜生物标本超薄切片的制备（已由老师完成）

1．取材 用锋利的刀片切取1mm3目标样本组织，立即投入固定液中，取材要迅速，以防止细胞缺氧发生超微结构变化。

2．固定 把样本立即投入到0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5％戊二醛中，4℃固定二小时(也可用0.1mol／L(pH7.4)的磷酸缓冲液配制的2.5％戊二醛)。然后用0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1％锇酸中固定2小时(4℃)。

3．脱水 用双蒸水清洗固定好的标本，按顺序投入到30％、50％、70％的乙醇中，在4℃条件下各10分钟．然后再投入到80％、90％、95％的丙酮中各10分钟，100％的丙酮中两次，每次10分钟。

4．浸透 把标本由100％丙酮中移入装有混匀包埋剂的小瓶中，在30℃下震荡4小时(可用红外线灯加温促进浸透)使包埋剂置换出标本中的丙酮。电镜生物标本常用环氧树脂作包埋剂，聚合后可切成超薄切片，并耐电子束轰击。

5．包埋 把标本放入胶囊底部，将混匀的包埋剂分装入胶囊中，加好标签，勿使倾倒保持直立。

6．聚合 把装有标本和包埋剂的胶囊置35℃、45℃、60℃温箱中各24小时，使包埋剂聚合，硬化，由流体变为均匀的固体。

7．超薄切片 一般透射电镜的切片厚度不能超过100nm，通常超薄切片厚度为50～70nm。在切片前，要对标本包埋块顶端修成近45℃角的四边锥体，使要进行切片的标本露出外表面，呈长宽约为0.4×0.6mm的长方形或梯形切面。然后再把标本块夹在标本夹中，并把它固定在切片机臂的远端。切片刀为钻石刀或玻璃刀 (先从长玻璃条上切取正方形玻璃

块，再沿玻璃块对角将其切割为两块，即为两块玻璃刀)，刀刃周围围成水槽，装满水，切下的切片即漂在水面，以400目铜网收集之。切片的厚度可以从切片机处设定。

8．染色 将样本置入枸缘酸铅染液中染色，1％NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后观察。

实验结果及讨论

样本横纹肌细胞中的线粒体：线粒体的外形多样，呈圆形、椭圆形、哑铃形或杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体脊的数目与分布方式多种多样，一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。

第二篇：电镜实验报告