09级本科生细胞生物学电镜实验 20xx年9月

贴壁培养细胞表面形貌的扫描电镜观察

【实验目的】

1. 了解扫描电镜生物样品制备的基本过程

2. 了解扫描电镜的基本操作

【实验原理】

扫描电镜的基本原理：扫描电子显微镜是以能量为1-30KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成象，获得试样表面微观组织结构和形貌信息。

其核心是电子光学系统，又分为两个部分：电子枪和透镜系统。

电子枪：提供电子束。来自热阴极或场发射阴极的电子被1-30KV的电压加速，由阳极孔射出，形成一交叉电子束。其交叉斑对于热阴极为10-50μm，对于场发射阴极为10-100nm。

透镜系统：由两个或三个电磁透镜组成，改变透镜的励磁电流可连续调节透镜的焦距，在透镜系统的作用下，能将电子枪形成的电子束交叉斑缩小，在样品的表面形成最小直径为3-10nm的电子束照射斑。

（图1）扫描电镜的基本构造示意图

相互作用：当电子束轰击样品表面时，一部分的能量转变成热能，还有部分的能量由于电子与样品原子的相互作用而发射出各种有用的信息，其中包括二次电子、背散射电子、俄歇电子等等。

二次电子：入射电子使样品原子激发所产生的电子，能量较低，一般小于50eV。具体来讲，它是由入射电子与核外松散的被束缚的外层电子之间发生非弹性散射的结果。松散的外层电子由于入射电子能量的降低而获得一定能量而脱离原有的轨道，而为人们所探测

09级本科生细胞生物学电镜实验 20xx年9月 到；但如果它们产生在样品表面以下100?的地方，则这些二次电子被样品强烈吸收，难以逃逸。因此二次电子反映样品表面以下100?的一个薄区域的情况。

成像原理：来自扫描发生器的扫描信号分别送给电子光学系统的扫描线圈和显象管的扫描线圈，让电子束与显象管的阴极射束做同步扫描，使阴极射束在荧光屏上的照射点与电子束在样品上的照射点一一对应，样品上的物点在电子束作用下所产生的信号被检测器随时检出，经视频放大器放大后控制显象管阴极射束的强度使荧光屏上象点的亮度受试样上物点所产生的信号的大小的调制，从而得到与样品性质有关的图象。

临界点干燥：临界点干燥技术是实验室中为保持较好的样品外形而常用的一种干燥方法，因为细胞或者组织如果在空气或真空环境中进行干燥，待观测表面将会塌陷或遭受其他损伤。干燥过程中，我们常用临界点较低的液化气体，一般采用液态CO2 取代乙酸异戊酯，然后升温，让液体瞬间汽化，将样品表面的其他物质都带走，实现干燥操作。

干燥器：主体是一个集成有加热冷却夹套的压力干燥器，干燥器上装有各种控制阀、温度计、压力表和支架，圆柱舱的一端装有可拆式观察窗，另一端装有可拆式进样门等等。在使用临界点干燥液取代载液乙酸戊酯之后，关闭所有阀门，开始水浴加热。此时，液/气弯界面将扩散消失，舱内仅剩下气体。稍稍开启排气阀，待气体排出后，组织样本的干燥即完成。

【实验仪器、材料、试剂及用品】

1) 仪器：扫描电镜（HITACHI S-4800）、临界点干燥仪（HITACHI HCP-2）、离子溅射镀膜仪（EIKO IB-3）

2) 材料：贴壁培养细胞（HeLa细胞）

3) 试剂：2.5%戊二醛溶液、磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水等

4) 用品：培养皿、盖玻片、镊子、移液器、双面胶带、扫描电镜样品台等

【实验步骤】

1） 取样、清洗：对多数的生物材料而言，要经过扫描电镜观察其表面，首先必须采用化学或物理方法将其固定、脱水和干燥，然后喷金以提高材料的导电性和二次电子产额。第一步则是将培养好的样品放入小培养皿中，用0.1mol/l的磷酸缓冲液把样品表面的附着物清洗干净。

2） 固定：用移液枪取1ml的2.5%的戊二醛溶液固定1h，然后用0.1mol/l的磷酸缓冲液再次清洗。（理论上也可用1%的四氧化锇单固定，四氧化锇也可以良好地保存组织细胞

09级本科生细胞生物学电镜实验 20xx年9月 结构，增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图像的质量。）

3） 脱水、置换：用磷酸溶液和蒸馏水清洗之后，换用30%、50%、70%、80%、90%、95%、以及无水乙醇进行脱水处理，每次用移液枪注入1ml的液体，刚好浸没样品，换液时将原来的液体吸出，换上新的液体，每次干燥10分钟左右。然后再用乙酸异戊酯置换酒精，大约10分钟，将乙酸异戊酯移出。

4） 干燥：临界点干燥法，将样品小心移入小样品盒中，将盖子盖好，然后放入干燥器的样品室，盖上盖子，然后打开阀门，注入60%左右的液体二氧化碳，关上阀门，在温度相对较低的情况下，让二氧化碳充分的溶解替换乙酸异戊酯，然后加热至35至40℃，让液体汽化，然后打开排气管，缓慢排气，直到压强降到一个大气压为止。

5） 喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层金属膜,以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图像质量，并且防止样品受热和辐射损伤。

6） 显微成像：将样品小心放到扫描电镜操作台上显微成像，通过旋钮调焦，找到细胞，观察，照相。

【实验结果】

（图2）显微照相HeLa细胞

09级本科生细胞生物学电镜实验 20xx年9月

（图3）显微照相HeLa细胞

通过以上两张非常具有立体感的照片，我们可以看出细胞紧贴着盖玻片生长，几乎形成一片薄膜，且边缘有丝状延伸；细胞表面有很多微小的绒毛以及突起。

【结果分析】

1） 表面裂痕：可能是由于干燥造成的损伤。Hela细胞贴壁生长的那一部分几乎只剩下细胞膜，容易断裂，特别是在经过多次脱水干燥之后。

2） 丝状延伸：分析有可能是为吸附盖玻片所形成，经过脱水、干燥，细胞膜紧紧吸附玻璃表面。

3） 微绒毛：极小的绒毛有可能就是细胞膜磷脂双分子层表面的成像，稍大一点的片状或条状的突起有可能是细胞表面的糖类物质，其识别通讯等作用。

4） 瘤状突起：有可能只是细胞本身的形态，也有可能是外来物质诱发了细胞的胞吞和胞吐；通过大小的对比，也不能排除是微生物入侵细胞的可能。

【注意事项】

1 将样品待观察面向上放入临界点干燥室，在这之前一定要将多余的乙酸异戊酯事先吸收掉。

2 如果注液态二氧化碳的量过少，则压力大不到临界赶早点的要求；如果量过多则压力过大，对实验仪器或者排气时间也有影响。所以注入的液体要适量，最好在60%左右。

09级本科生细胞生物学电镜实验 20xx年9月 3 排气阀和排液阀的作用是在进行液化气取代时实现充分的混合。如果要达到最佳的干燥效果，必须将组织样本中的载液完全去除并排出舱体。如果进液阀和排气（或排液）阀同时开启，舱内会立即产生湍流和奔涌。

4 为了确保样本不会出现液体二次凝结，我们建议在此操作时将温度控制于临界点之上至少5°C

5 扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。

第二篇：电镜技术与细胞超微结构_三个实验报告

实验一 载网的认识和样品支持膜的制备

一、载网的认识

识别铜网的正反面：正面光滑较亮；反面较粗糙，边框较亮，中间较暗。

二、福尔莫瓦支持膜的制备

1．在水槽内盛满蒸馏水将已配好的福尔其瓦溶液倒入立式载玻缸或小烧杯中，另将若干新载玻片浸入装有0.02％中性皂液的载玻缸中。

2．取一载玻片，用白绸布擦净，使之光洁，然后手持载玻片一端，插入福尔莫瓦溶液中，再垂直匀速取出，在空气中稍晾片刻，使其形成一层膜。用刀片在膜的四周各划一条刻痕，对膜哈气后，将载玻片有膜一端成45度角或垂直慢慢压入水中，使膜缓缓地被剥离并漂浮在水面上，取出裁玻片。

3.根据Formvar膜在水面上呈现的干涉色检查膜的厚度，选取厚度均匀的银灰色的膜。淡黄色的较厚，浅红色的更厚都不能用。颜色不均匀、有皱纹和尘埃或破损的不能用，弃去。

4. 将清洁的铜网排列在膜上，然后剪取一块比膜的面积稍大的滤纸片与有铜网的膜贴附，随着滤纸的吸湿逐步与膜、铜网阽附好后，边提边向上翻转离开水面，放置在有滤纸的平皿中，干燥后放于干燥器中保存备用。

实验二 透射电镜生物样品的制备

一、取材：

（1）动物样品：用乙醚麻醉小白鼠进行活体解剖，取出所需组织器官放在预冷的载玻片上，立即滴加预冷的3%戊二醛固定液。用锋利的刀片将组织先切成宽1mm，长3~4mm的小条，再切成1mm3的标准小块（肌肉组织应该保持截面积为1mm2的长条状），用牙签拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中。

（2）植物样品：从植株上取下试样立即放在预冷的载玻片上，并滴上数滴预冷的3%戊二醛固定液，用锋利刀片切取1mm宽，3~4mm长的小条，然后用牙签轻轻地拨入盛有冷的3%戊二醛固定液的小瓶中（小瓶置于冰盘中以保持0~4℃）, 叶片需盖紧瓶塞后用注射器或置于真空干燥器中抽气，直至样品沉落瓶底。

二、前固定：更换新鲜的3%戊二醛固定液，固定2～5小时或过夜，在0~4℃进行。

三、漂洗：用吸管吸出戊二醛固定液，加入0.1M的磷酸缓冲液漂洗三次，每次15~20分钟。

四、后固定：吸出漂洗液，在通风橱中加入1%的四氧化锇固定液，固定2小时后，吸出固定液，加入0.1M的磷酸缓冲液漂洗三次，每次15~20分钟。

五、脱水：吸去缓冲液，注入乙醇逐级梯度脱水：50%、70%乙醇0~4℃下各15分钟； 80%、90%、95%乙醇室温下各15分钟；100%乙醇两次，每次15分钟。再转入环氧丙烷，室温下置换两次，每次15分钟。

六、浸透：按照Epon812环氧树脂包埋剂配方配制包埋剂，必须充分搅拌，混匀后分步进行浸透。（1）环氧丙烷：包埋剂=3：1，浸透1小时；（2）环氧丙烷：包埋剂=1：1，浸透1小时；

（3）环氧丙烷：包埋剂=1：3，浸透2小时；纯包埋剂浸透2~5小时。每一级浸透都将样品瓶置于往复式振荡器上，以加速浸透而缩短浸透时间。

七、包埋：将胶囊立插入胶囊架上，把样品用牙签挑入胶囊底部正中间，注入包埋剂并插入标

签。纤维类等有方向要求的样品，应该用浅槽模板作定向包埋。

八、聚合：将包埋板放入37℃烘箱中12小时，45℃烘箱中12小时，60℃烘箱中24小时，取出即为样品包埋块。

九、包埋块的修整：

1、剥去胶囊，将包埋块安装在样品夹头上，顶端露出3~5mm。先用单面刀片水平横切包埋块顶端的包埋介质，直至样品将被暴露出来。再将包埋块顶部四周的侧面切四刀，将包埋块上部切成金字塔形，塔顶面积约1mm2。

2、在实体显微镜下用新的单面刀片进一步修整顶面，使其光滑平整，最好呈梯形或长方形，上下两边要求平行，顶面积约0.5×0.5 mm2，四个斜面坡度以45°为宜。

十、玻璃刀的制作：

1、制方形玻璃块：玻璃条洗净擦干，利用制刀机切断成方块。将玻璃条一端插入夹头底部，转动固定杆使夹头下落，夹紧玻璃条；拉动划割器，使下部碳化钨砂轮划割玻璃条；向右转动断裂旋钮对玻璃条加压，使玻璃条沿划痕断裂，再转动固定杆抬起夹头，取出剩余的玻璃条。

2、制玻璃刀：用托架取出方形玻璃块，旋转45°角之后，置于夹头下；转动固定杆使夹头落下压紧方形玻璃块，拉动划割器，然后转动断裂旋钮，使有刻痕的方形玻璃沿着对角线断裂形成两块三角形的玻璃刀；用托架取出玻璃刀。

3、制作水槽：检查刀口合格的玻璃刀，沿着刀口齐用专用胶带做一水槽，并用石蜡封好以防漏水。

十一、超薄切片：

1、安装玻璃刀和包埋块：

（1）按照超薄切片机的操作程序，打开电源接通照明。

（2）将玻璃刀安装在刀座上，使刀口高度与刀座上的标杆高度相等，刀的前倾角为4°左右，夹紧。

（3）将夹有样品包埋块的夹头装在样品臂上，夹紧。通过超薄切片机上的双筒显微镜边观察，边调整样品块与刀的相对位置，旋转样品头夹具，调整刀座的位置，使样品包埋块端面与刀刃在三维方向上都平行。

（4）用注射器向玻璃刀水槽中注入双蒸馏水，并调节液面高度使之与刀刃一致。

2、切片：切片厚度选择0.5～2?m左右，以手动推进或半薄推进方式切出若干半薄切片。用细玻璃棒将切片捞在载玻片上的水滴中，再将载玻片移在酒精灯上方烘烤，待水滴干后切片就贴在载玻片上。用滴管吸一滴2%的亚甲蓝染色1~2分钟，洗去多余的染色液，烤干后用光镜检查。根据观察情况再对包埋块作适当的定位修整。重新选择最佳刀刃，将切片速度调至2~3mm/秒，切片厚度选择50nm左右，进行超薄切片并微调切片厚度，直到水槽表面观察到切出灰色、银白色、浅黄色的片子为宜。

3、展片和捞片：用滤纸沾少许氯仿溶液，在切片上方停留片刻，利用有机溶剂的挥发气体使切片展平（注意：不能触及水面和切片）。用睫毛针将符合要求的切片拨在一起，然后用镊子夹持载网膜面朝下，使载网与切片所在的水面平行，对准切片并迅速与切片接触，沾取切片。用滤纸沿着边缘吸去水分。

十二、染色：

1、铀染：用滴管将醋酸双氧铀染色液滴于蜡盘中，将有切片的载网膜面朝下漂浮在染色液滴的表面上。20~30分钟后用镊子持载网，依次在三个盛有双蒸馏水的小烧杯中清洗，然后将载网放在干净的滤纸上。

2、铅染：在另一个蜡盘中的四周放一些固体NaOH，吸取柠檬酸铅染色液滴于蜡盘中，然后将经过铀染后尚处于半干半湿的载网膜面朝下漂浮在染色液表面，盖好盖子以减少染色液与空气接触，染色10~15分钟。然后用镊子夹持载网立即浸入盛有0.1N的NaOH溶液中清洗，再依次于另外三个盛蒸馏水的小烧杯中清洗，摆放在干净的滤纸上，自然干燥后即可观察。

实验三 常规扫描电镜样品制备技术

1、准备样品托：用抛光膏擦净样品托正面后，再用棉签蘸丙酮擦净台面上的抛光膏，凉干备用。

2、取样与清洗：（1）植物样品先用水冲洗掉表面泥土和灰尘，叶片切取10mm2小片，根或茎可切取10mm长的小段，立即投入2％的戊二醛固定液中；（2）小鼠内脏及肌肉组织切成厚度为1mm、大小为10mm2的片状，立即投入2％的戊二醛固定液中。

3、固定与清洗：扫描电镜样品的固定处理包括预固定、前固定、漂洗、后固定、漂洗五步组成，所用固定剂的种类、操作和条件与透射电镜超薄切片实验基本相同（参见实验二）。由于扫描电镜仅观察样品的表面形态，样品可适当增大，并可以根据样品块的大小适当缩短固定时间。

4、脱水：用50％～100％系列乙醇脱水。

5、置换：第一步：置换乙醇。用滴管吸去脱水剂并迅速注入醋酸异戊脂与脱水剂1：1的混合液，浸渍10～20分钟吸弃上述混合液，注入纯醋酸异戊脂，摇动并浸渍10～20分钟。第二步：置换醋酸异戊脂。先将样品由小瓶中取出，保持湿润状态下装入临界点干燥仪的样品笼中，再把样品笼摆放到预冷过的临界点干燥仪的样品室中。盖紧样品室上盖，充入液态二氧化碳（液面须高于样品笼面）。缓慢排出二氧化碳，直到室内尚存少量二氧化碳，能保持样品湿润为止。重复充液排气操作三次。

6、临界点干燥：打开进液阀门，向样品室内充入液态二氧化碳（高度不超过样品室高度的80%）。将加热温度旋钮设置到32℃，对样品进行加热，并监测压力表，当温度达到32℃、压力超过73大气压时，可通过观察窗观察室内二氧化碳状态，若二氧化碳呈现混浊态，即达到临界状态。在保持32?/73大气压状态下，以低于2L/min，速度排气，直到压力表气压降到零为止。

7、粘贴样品：等待样品室温度回升到室温时，打开样品室，取出样品笼，用牙签将少量导电胶涂在样品台上，胶面应该稍微小于样品底面积。用镊子轻夹样品侧面，待观察面朝上，将样品置于已涂胶的样品台上。

8、离子溅射镀膜：开启电源和真空泵。打开真空罩，装入样品托，盖严真空罩（可适当涂抹甘油以保证密封良好）。溅射仪手柄转向“真空”位置，开始抽真空，注意观察真空表，待真空度优于0.1乇后，可以加高压进行溅射。镀膜开始缓慢调节高压旋钮加大高压，可观察到产生紫色辉光放电现象，增大电压时，辉光增强。同时注意观察真空表的指示，使真空度保持在指定区域内，溅射直到符合样品要求为止。等待片刻，放气、开罩，取出样品托放入干燥皿中。