实验十二 旋光法在食品分析中的应用
1. 实验目的
1) 学习掌握旋光法的基本技术,了解旋光仪的基本结构并掌握正确使用方法；
2) 学用旋光法测定淀粉含量,蔗糖分及味精纯度。
2. 实验原理
旋光法是利用物质的旋光性质测定溶液浓度的方法。许多物质具有旋光性，当平面偏振光通过这些物质（液体或溶液）时，偏振光的振动平面向左或向右旋转，这种现象称为旋光。偏振光旋转的角度称为旋转角。
旋光法可以用各种光学活性物质的定量测定或纯度检验，甚至可测定旋光物质的反应速率常数。如测定糖类含量，糖类是旋光性较强的物质，当偏振光通过糖类溶液时，产生旋转角度与糖类溶液的体积百分浓度成正比，因此可以推算糖类溶液的含量。
3. 仪器及材料
3.1仪器
WZZ-2B型自动旋光仪
3.2试剂
1）氯化钙溶液:溶解546g CaCl2·2H2O 于水中，稀释至1000mL，调整相对密度为1.30(20℃)，再用1.6%的醋酸调整PH值为2.3～2.5，过滤后备用；
2）氯化锡溶液:称取2.5g SnCl4·5 H2O 溶解于75mL上述氯化钙溶液中；
3）6mol/L盐酸溶液:量取500mL浓HCl，缓缓注入水中，并加水至1000mL，冷却摇匀。
3.3 材料
木薯淀粉或面粉，白砂糖，味精
3.4注意事项
1）温度对旋光度有很大影响.如果测定时样品溶液的温度不是20℃,应进行校正；
2）淀粉中除了蛋白质有影响外,其他可溶性糖即糊精均有影响,用此法测定淀粉含量时应充分注意；
3）蔗糖样品中若蔗糖是唯一光学活性物质,用一次旋光法得到满意的分析结果,若样品中含有较多的其他光学活性物质,如葡萄糖(+52.5o)，果糖(-92.5o)等，则应采用二此旋光法。
4. 实验步骤
4.1 样品制备
4.1.1 淀粉测定
称取淀粉样品2.000g,置于250mL烧杯中,加水10mL,搅拌使样品湿润,再加入70mL氯化钙溶液。盖上表面皿,在5min内加热至沸,并继续加热15min,加热过程中应随时搅拌,防止样品粘附在烧杯壁上,若泡沫过多,可加入 1～2滴辛醇消泡。迅速冷却,移入100mL容量瓶中,用氯化钙溶液洗涤烧杯上附着的淀粉,洗涤液并入容量瓶中,加5mL氯化锡溶液,用氯化钙溶液定容,混匀,过滤,并弃去初滤液,收集滤液待用。
4.1.2 蔗糖分测定
称取规定量白砂糖样(26.000±0.002g)于干净的小烧杯中,加入40～50mL水,以细玻璃棒搅拌使其完全溶解后,倾入100mL容量瓶中,多次洗涤小烧杯,洗水一并倒入容量瓶并定容至刻度。如有混浊,用滤纸过滤后待用,用2dm旋光观测管。
4.1.3味精纯度测定
称取10.000g味精于小烧杯中,加40～50mL水,再加32mL6mol/L 盐酸溶液,溶解后移入100mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀,待用。
4.2测定
1）打开旋光计的电源，经5～10min稳定；
2）检查是否放入滤光片，取待用的旋光管装满蒸馏水，如有气泡，须赶入凸颈内。用软布擦干两端护片上的水。旋光管的螺帽不宜过紧，以免产生应力，影响读数。旋光管每次所放的位置和方向都应一致；
3）打开示数开关,调零位手轮,使旋光示值为零；
4）关闭示数开关，取出旋光管，换上待测样品，按相同位置和方向放入样品室，盖好仪器显示度数即为旋光度；
5）逐次掀下复测按纽,重复读数几次,取其平均值.
5. 结果与分析
5.1 面粉淀粉含量计算与分析
式中： 
——淀粉的质量分数，%； 
——样品的旋光度；
——淀粉提取剂的旋光度； L——旋光管的长度，dm；
M——样品的质量，g； 203——小麦淀粉的比旋光度。
5.2 白砂糖中蔗糖分含量测定与分析
式中： ——白砂糖中蔗糖的质量分数，%；
——按标定条件下测得的样品旋光度； 2.887——换算系数。
5.3味精纯度计算与分析
式中： ——味精中谷氨酸钠的质量分数，%； 32——L-谷氨酸钠的比旋光度（20℃）
147.13——L-谷氨酸的摩尔质量数； L——旋光管的长度，dm；
M——样品的质量，g； 187.13——谷氨酸单钠·H2O摩尔质量数。
5.4 数据记录
表一 旋光法测得数据记录表
经计算得：
面粉淀粉含量=82.5%；蔗糖分含量=99.61%；味精纯度=82.8%
6. 讨论与心得
6.1思考题
（1）影响旋光度的因素有哪些？
答：溶剂的影响：旋光物质的旋光度主要取决于物质本身的结构。另外，还与光线透过物质的厚度，测量时所用光的波长和温度有关。如果被测物质是溶液，影响因素还包括物质的浓度，溶剂也有一定的影响。因此旋光物质的旋光度，在不同的条件下，测定结 果通常不一样。因此一般用比旋光度作为量度物质旋光能力的标准
温度的影响：温度升高会使旋光管膨胀而长度加长，从而导致待测液体的密度降低。另外，温度变化还会使待测物质分子间发生缔合或离解，使旋光度发生改变。
浓度和旋光管长度对比旋光度的影响：在一定的实验条件下，常将旋光物质的旋光度与浓度视为成正比，因为将比旋光度作为常数。而旋光度和溶液浓度之间并不是严格地呈线性关系，因此严格讲比旋 光度并非常数.旋光度与旋光管的长度成正比。旋光管通常有10cm、20cm、22cm三种规格。经常使用的有10cm长度的。但对旋光能力较弱或者较稀 的溶液，为提高准确度，降低读数的相对误差，需用20cm或22cm长度的旋光管。
（2）使用旋光仪有哪些注意事项？
答：1）测定前应将仪器及样品置 20℃ 士 0.5℃ 的恒温室中或规定温度的恒温室中，也可用恒温水 浴保持样品室或样品测试管恒温 lh 以上， 特别是一些对温度影响大的旋光性物质，尤为重要。
2）未开电源以前，应检查样品室内有无异物，钠光灯源开关是否在规定位置，示数开关是 否在关的位置，仪器放置位置是否合适，钠光灯启辉后，仪器不要再搬动。
3）开启钠光灯后，正常起辉时间至少 20min，发光才能稳定，测定时钠光灯尽量采用直流供 电，使光亮稳定。如有极性开关，应经常于关机后改变极性，以延长钠灯的使用寿命。
4）测定前，仪器调零时，必须重复按动复测开关，使检偏镜分别向左或向右偏离光学零位。 通过观察左右复测的停点，可以检查仪器的重复性和稳定性。如误差超过规定，仪器应维修 后再使用。
5）将装有蒸馏水或空白溶剂的测定管，放入样品室，测定管中若混有气泡，应先使气泡浮 于凸颈处， 通光面两端的玻璃， 应用软布擦干。 测定时应尽量固定测定管放置的位置及方向， 做好标记，以减少测定管及盖玻片应力的误差。
6）同一旋光性物质，用不同溶剂或在不同 pH 值测定时，由于缔合、溶剂化和解离的情况不 同，而使比旋度产生变化，甚至改变旋光方向，因此必须使用规定的溶剂。
7）浑浊或含有小颗粒的溶液不能测定，必须先将溶液离心或过滤，弃去初滤液测定。有些 见光后旋光度改变很大的物质溶液， 必须注意避光操作。 有些放置时间对旋光度影响较大的， 也必须在规定时间内测定读数。
8）测定空白零点或测定供试液停点时，均应读取读数三次，取平均值。严格的测定，应在 每次测定前，用空白溶剂校正零点，测定后，再用试剂核对零点有无变化，如发现零点变化 很大，则应重新测定。
9）测定结束时，应将测定管洗净晾干放回原处。仪器应避免灰尘放置于干燥处，样品室内可 放少许干燥剂防潮。
6.2实验心得
本次我主要学会了用旋光法进行测定以及旋光仪的使用等基本操作，掌握了相关实验测定条件的选择。我学会到了实验的设计思想，用氯化钙溶液提取样品中的淀粉,使之与其他成分分离,用氯化锡溶液沉淀提取液中的蛋白质等杂质,测定旋光度,即可计算出样品中淀粉含量。以及对于纯度很高的成品白砂糖,由于旋光性非蔗糖物的含量已很微少,故可采用一次旋光法测定蔗糖分。
不出意外的话，本次试验应该是本学期最后一次实验了，不敢说在整个学期的实验中学到了很多东西，掌握了很多实验操作，但在团队合作、分工等方面确实积累了一定的经验。而且对自身存在的很多不利实验操作的因素得到了很好的剖析。
第二篇：高效液相色谱法在食品分析中的应用
高效液相色谱法在食品分析中的应用
摘要：综述高效液相色谱法在食品分析中的应用，通过参考近20篇相关文献，主要介绍了高效液相色谱法在食品中黄曲霉毒素、食品中农兽、药残留量、食品中各种添加剂及食品贮藏过程产生毒素每方面的分析测定中的应用。基本上反应了高效液相色谱法在食品分析领域的最新应用，并阐明了独到的见解，具有一定的参考价值。
关键词: 高效液相色谱法 黄曲霉毒素 残留农兽药 添加剂 毒素
0 引言
高效液相色谱法是六十年代末、七十年代初发展起来的快速分离分析的方法。它的基础是液相柱层析［1］。由于新型固定相、性能良好的高压输液泵以及具有选择性的高灵敏的检测器的使用, 尤其是近年来利用电子计算机进行自动化控制及数据处理, 使液相色谱法得到了很大的发展。高效液相色谱法被广泛应用于许多领域, 同样亦被应用于食品分析领域。它不仅可以对食品中各类营养成分及含量进行分离和测定, 而且还可以对食品中残留的一些有害的微量物质及在食品腐败过程中产生的各种毒素进行分析［2］, 从而向人们展示出高效液相色谱法在食品分析中的重要地位。
1 食品中黄曲霉毒素的测定
黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的真菌毒素，目前已分离鉴定的有近20种，是一类化学结构相似的物质，其中以 B1、B2、G1、G2 和M1、M2为主。在天然污染的食品中以B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。林裕［3］建立HPLC测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，采用ALLSPHERE ODS （250×416 mm）色谱柱，流动相为乙腈/水（梯度洗脱），荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。结果最低检出的B1、B2、G1、G2分别为浓度0.20 μg/kg，0.05 μg/kg，0.20 μg/kg，0.05 μg/kg。样品进行净化、衍生处理后，用荧光检测器检测，检出的浓度比国标法［4］提高10倍。
2 食品中农、兽药残留量的测定
为了防止粮食作物和蔬菜水果等的病虫害, 往往在它们的生长期内施加一定的农药。这些农药在收获的果实上的残留量就成为人们关注的问题。尤其是有些有机农药对人体健康的危害不能不引起人们的重视。高效液相色诸法提供了分析残留农、兽药量的一种较好的方法。
2.1 蔬菜水果中农药残留量的测定
目前蔬菜水果中不同种类农药的残留测定方法主要是气相色谱法(GC)或气相色谱 －质谱法 (GCMS )，但GC对沸点高或热稳定性差的农药需进行衍生化处理，这样就不可避免地增加了样品前处理的难度，也使它的应用受到一定程度的限制。李永新［5］等建立了同时测定蔬菜水果12种农药残留的反相高效液相色谱分析方法。将样品捣碎，用乙酸乙酯超声提取，经Florisil固相萃取柱净化、正己烷二氯甲烷( 1∶1)洗脱、氮气吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色谱柱分离、紫外检测，以外标法定量。结果表明：5种有机磷农药、6种拟除虫菊酯类农药和除草剂二甲戊乐灵的检测限为0.114～2.65 ng。应用该法对从市场上随机购买的莲白、小白菜、黄瓜等20个蔬菜样品和苹果、梨等20个水果样品进行检测，其中氧化乐果的检出率分别为55%和45%，辛硫磷的检出率分别为50%和30%，由此可见，国家明文规定的不得用于蔬菜、瓜果的剧毒、高毒农药仍有检出。
2.2 肉类中残留兽药量的测定
激素是由内分泌腺和散在其它器官的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，动物和人体内正常时含量甚微，残留于动物性食品中的激素常为性激素，当性激素超过人体正常水平时，会破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。因此对食品中激素残留的测定十分重要。王帆［6］等研究检测大豆异黄酮类保健食品中三种雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)含量的分析法。采用Hypersil ODS2 Cl8色谱柱，流动相为甲醇水(体积比53∶47)，流速 1.0 ml/min，检测波长280 nm，该方法的线性范围在 0.5～250 mg/L，三种雌激素的最低检出限分别为0.8、0.9、0.4 mg/L。
3 食品中各种添加剂含量的测定
3.1 食品防腐剂的分析测定
苯甲酸和山梨酸是食品中最常使用的两种防腐剂。对于它们的分析过去常用分光光度法和气相色谱法进行, 但要经过繁杂的预处理操作。近年来发展了高效液相色谱法只需经过简单的处理, 就可直接进行测定。我国秦皇岛卫生检验所的赵惠兰等报导了用高效液相色谱法快速测定饮料中苯甲酸、山梨酸的方法［7］。他们将饮料过滤后直接注入液相色谱系统。10—20min 可同时测定这两种防腐剂及糖精钠的含量。该法的色谱条件是：以uBandapak C18柱为分析柱，含有0.02M醋酸胺的甲醇水（35：65）溶液为流动相, 洗脱速度1ml/min,在 254um的紫外检测器进行检测。该法的回收率97%。标准差为0.29，变异系数为0.038。
武汉市产品质量监督检验所的周胜银、李增也报导了用高效液相色谱法测定酱油及软饮 料类样品中防腐剂的方法［8］。
3.2 测定食品中非食用色素
酸性橙Ⅱ、碱性橙2 和碱性嫩黄O 均为工业染料，用于染丝、麻、皮革等，这3 种物质均可以使人致癌，根据GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定，这3 种物质严禁作为品使用。但不法商贩利用其颜色鲜艳、着色稳定、价廉的特点非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，严重危害了广大消费者的身体健康[9]。：建立食品中的酸性橙Ⅱ、碱性橙2 和碱性嫩黄O 染料残留的高效液相色谱同时测定的方法，样品通过提取之后，采用基质固相分散法净化，然后分别用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脱，最后进行HPLC 分离、检测。此法的回收率平均为79 ％，酸性橙Ⅱ的检出限为0.01 mg/kg、碱性橙2 的检出限为0.02 mg/kg，碱性嫩黄O 染料的检出限为0.01 mg/kg，相对标准偏差平均为3.53 ％[10]。
4 食品贮藏过程产生毒素的测定
一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。20xx年4月瑞典斯德哥尔摩大学Margareta Tornqvist教授，首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物——丙烯酰胺(Acrylamide)，该毒物很容易经消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，并能通过胎盘屏障，是一种公认的神经毒素和准致癌物，已被WHO国际癌症研究中心(IRAC)列为可能致癌物质(ⅡA 类)。20xx年4月13日我国卫生部发布了“建议全国消费者避免食用油炸薯片和油炸薯条”的公告，呼吁采取措施减少食品中丙烯酰胺可能导致对健康的危害。柳其芳［11］等检测食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取，二极管阵列检测，反相高效液相色谱测定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱对样品液进行纯化，流动相为甲醇水(体积比5∶95)，DAD扫描波长范围190～370 nm，检测波长210 nm。结果丙烯酰胺在0.1～10 mg/L 浓度范围内线性良好，方法检出限为10 ng/g。用建立的方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品，结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。食品贮藏不当，会引起真菌生长，造成食品的腐败变质，同时有些霉菌产生的霉菌毒素，具有较强的毒性和耐热性。
5 其他
5.1 高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量
水产饲料中添加喹乙醇对增加水生动物的抗病性和促进生长有一定的效果, 但是长期添加和过量添加会给鱼类造成极大的危害。国家已明令禁止在水产饲料中使用喹已醇[ 12] , 但一些饲料厂家仍大量使用, 添加量高达50~ 150 mg/ kg喹乙醇的蓄积毒性不但能使养殖鱼类发生中毒或死亡, 而且喹已醇在鱼体内极易降解, 降解代谢物能抑制脱氧核糖核酸的合成, 对染色体畸变有影响, 属致癌物, 对人体健康有损害。因此在农业标NY5070-2002( 无公害食品水产品中渔药残留限量) 中规定喹乙醇不得检出[ 13] 。现在建立了一套简捷有效的样品前处理方法, 用高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量。[ 14]将草鱼、鲤鱼和鲫鱼等水产品去鳞、去皮、沿背脊取肌肉, 用高速匀浆机打成匀浆, 冷冻备用。称取样品5. 00 g 置于50mL 离心管中, 加入无水硫酸钠10 g 搅匀, 再加入乙腈30 mL, 涡旋混合2 min, 于振荡器上振荡提取15 min, 以3 600 r min- 1 转速离心10 min, 将上清液倒入125 mL 棕色蒸发瓶中后, 再向离心管中加入乙腈20 mL, 重复操作一次,合并上清液。在40 ! 水浴下旋转减压蒸发至近干,向棕色蒸发瓶中加入流动相1. 00 mL 和正己烷( 用乙腈饱和) 10 mL, 充分洗涤溶解残留物后, 倒入10 mL离心管中, 静置或离心分层后, 下层液经0. 45 m微孔滤膜过滤后, 按色谱条件进行测定。
5.2 高效液相色谱法分析调味品
高效液相色谱法亦被用于分析食物调味品。例如J.D.BARANOWSKI报导了用高效液相色谱法分离生姜辣味成分的方法[ 15]。又如Bbathnanathic M 和 BuckleH.A报导了用高效液相色谱法测定胡椒中胡椒碱的方法[ 16]。
6 小结
综上所述, 高效液相色谱法在食品分析中的应用是广泛的。所有实验均表明, 在食品分析中高效液相色谱法是一种高效能、高灵敏度、高准确度及操作简便的分析办法。随着新型检测的问世及与计算机的联用, 高效液相色谱法将在食品分析中发挥更大的作用。
参考文献：
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