实验一    培养基的制备和灭菌

一、目的要求

1  掌握配制培养基的一般方法和步骤。

2  学习高压灭菌锅的操作方法。

二、基本原理

乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；由于辐射能使空气中的氧电离成[O]再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成过氧化氢H2O2，O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

三、器材

天平，高压蒸汽灭菌锅，电烘箱，1mol/L NaOH,1mol/L HCl，培养皿，试管，吸管，酒精灯，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，接种环，牛角匙，pH试纸(pH5.5—9.0)，棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，麻绳。

四、操作步骤

1． 称量

（1）乳糖蛋白胨培养液：10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL

（2）细菌培养液：蛋白胨10g/L；酵母5g/L；氯化钠10g/L；加蒸馏水定容至1L。

（3）细菌加铜培养液：在细菌培养液的基础上加入终浓度分别为0、100、200、300的铜。

2．     溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

3．调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物，其PH的调节可用酸度计进行。

4． 分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内（见图Ⅰ－1）。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过容积达一半为宜。

5． 加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。

6. 包扎

加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一层牛皮纸或报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称，日期。

7. 灭菌

（1）  首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

（2）   放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞，

（3）   加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。

（4）   通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

（5） 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

8. 搁置斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在木条上（见图Ⅰ－2）。

           

 

9. 倒平板

将培养基溶化，待冷至55－60℃时，将几种培养基分别倒平板，每种培养基倒三皿。手持法（见图Ⅰ－5）：右手持盛培养基的试管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。如果试管内或三角瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法（见图Ⅰ－4）：将平皿叠放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇均后制成平板。

                    

10.无菌试验

将已灭菌的培养基，置无菌试管内，放在37℃孵箱中培养24小时，

将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

五、实验报告

1.如何检验灭菌后培养基是否合格？

2.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待降到0时才能打开排气阀，开盖取物？

第二篇：实验一 常用器皿包扎与培养基的配制和灭菌

实验一常用器皿包扎与培养基的配制和灭菌

一、实验目的

1 学会常用器皿包扎方法

2 学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤

3 学会实验室灭菌锅的使用方法

二、常用器具和仪器

试管（test tube），德汉氏小管（Durham tube），玻璃吸管（glass pipette），吸器，微量加样器（micropipette），吸嘴（tip），培养皿（petri dish），三角瓶（erlenmeyer flask），接种铲（inoculating shovel），玻璃涂布器（glass spreader），接种环（inoculating loop），接种钩（inoculating hook），接种针（ inoculating needle），小塑料离心管（Eppendorf tube），滴瓶（dropper bottle），双层瓶（double bottle），酒精灯(alcohol burner），煤气喷头（coal gas sprinkler head），试剂瓶，量筒，烧杯，温度计，石棉网，漏斗，烘箱，卧式灭菌锅，手提式灭菌锅，无菌操作台/室，过滤除菌设备，厌氧操作设备，小型发酵罐，离心机，培养箱/摇床，冷冻干燥机，蒸馏水器，超声波清洗仪，磁力搅拌器。

三、玻璃器皿的包装

1、培养皿的包装

方法一：用旧报纸密密包紧，一般以5-8套培养皿作一包。包好后用干热或湿热灭菌（见无菌操作技术）。

方法二：将培养皿放入金属（不锈钢）筒内，干热灭菌。金属筒配有盖子，内部还有一个可以放培养皿的带底框架。框架可以从筒内提出，以便装取培养皿。

包好的培养皿

金属筒和内部的框架

塑料培养皿架

2、吸管的包装

准备好干燥的吸管，在粗头端塞入一小段棉花，以免使用时将杂菌吹入或不慎将微生物吸出。

将吸管尖端斜放在旧报纸的近左端，与报纸成45°角，左端多余的一段覆折在尖头上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打个小结。

    包好的吸管再用一张大报纸包好，干热灭菌。或一起装入专用吸管筒进行灭菌。

    如果一次可以用完，也可以将吸管直接装入筒内。尖端向内，使用时将筒平放在桌面上，手持粗端抽出。

3、试管和三角瓶的包装

     试管管口和三角瓶瓶口塞以棉花塞或泡膜塑料塞，然后在外面用两层报纸包好，并用细线扎紧。若用铝箔更好，可以不用线扎。进行干热或湿热灭菌。

4、棉塞的制作：

    棉塞的作用主要是防止杂菌污染和保证通气良好，所以好的棉塞应该形状、大小和松紧与试管口或三角瓶口完全适合。

    加塞时，棉塞长度的1/3在管口（瓶口）外，2/3在内。

    一般用纤维长的棉花做塞子，不用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿，造成污染。

    此外，液体培养中还经常用到通气塞，即8层纱布重叠而成，或在两层纱布间均匀铺一层棉花作成。

四、玻璃器皿的清洗

新玻璃器皿：用2 %盐酸浸泡数小时后用自来水冲洗干净；

使用过的玻璃器皿：试管、培养皿、三角瓶等：用瓶刷沾去污粉等洗涤剂刷洗，再用自来水冲洗干净；装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤；

玻璃吸管：使用后投入有自来水的大量筒或标本缸内，以免干燥后不易清洗，再集中用自来水冲洗。

载玻片和盖玻片：滴加过香柏油的玻片要先用软纸沾二甲苯擦去油，在肥皂水中煮沸5-10 min，用软布或脱脂棉擦拭后用自来水冲洗。然后在稀洗液中浸泡2 h，再用自来水和蒸馏水冲洗晾干后浸于95 %乙醇中备用。

注意：带菌的器皿在洗涤前用 2 %煤酚皂溶液或 0.25 %新洁尔灭溶液等消毒液内浸泡 24 h或煮沸 30 min，再洗涤；

带病原菌的培养物先进行高压蒸灭菌，然后倒去培养物，再洗涤。

五、培养基的配制与灭菌

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：

牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000 mL，pH 7.4-7.6。

1 称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2 加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

3 调PH：检测培养基的PH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4 过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。

5 分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。

6 加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

7 包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8 灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。

9 摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。

10 无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。

六、实验任务

每人：

包扎4个平皿、2只吸管；2支装有9 ml的无菌水的试管

做2个试管塞、做1个三角瓶塞子并包扎好；做一支斜面。

每小组（两人一组）：包扎三角玻璃棒1支，配制200 mL培养基

六、思考题

1、配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?

答：称药品、加热溶解、调pH、过滤、分装、加棉塞、包扎、灭菌、摆斜面、无菌检查

注意问题：称药品用的各药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖，瓶盖切莫张冠李戴；调节pH时要小心操作，尽量避免回调而带入过多的金属离子；加热融化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分；配制好的培养基如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。

2、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查。

答：配制培养基的原料中有大量各种微生物存在，培养基配制好后立即灭菌是杀死所有微生物。如果不立即灭菌微生物会消耗培养基中的营养物质并产生代谢废物，从而使培养基失去其应有的营养特性或改变溶液的pH值。

       为检查灭菌后的培养基是无菌的可以将灭菌后的培养基放在37℃下培养24h，观察是否有微生物生长。

3、试设计实验对饮料进行无菌检查。