实验二  常用培养基的制备、消毒与灭菌

一、实验目的

1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。

2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法。

3.掌握玻璃器皿的包扎与洗涤。

4.了解常用灭菌方法的基本原理及应用范围，掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、实验原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。

灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。常用灭菌方法很多，一般可分为加热、照射和使用化学药品等方法。加热灭菌法分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160-170℃），时间要长（1-2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧的将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

三、实验材料

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、纱布、胶头滴管、全自动灭菌锅

四、实验方法与步骤

1、玻璃器皿的清洗——注意事项和方法

（1）用过的器皿应立即洗涤

（2）含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇到有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。

（3）载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡2小时，用清水冲净，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于95%酒精中保存备用。

（4）洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。

2、器皿包扎

（1）培养皿：洗净烘干的培养皿每6-8套（或根据需要而定）叠在一起，用报纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后灭菌。

（2）吸管、移液管：如图一所示洗净烘干的移液管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉，以防在使用时造成污染。每支移液管涌一条宽约4-5cm的纸条，以30-50°的角度螺旋形卷起来，移液管的尖端在头部，另一端用剩下的纸条打成一个结，以防散开，标上容量，若干支包扎成一束进行灭菌。使用时，从移液管中间拧断纸条，抽出移液管。

（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起到过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。

图一：移液管的包扎方法

图二：棉塞的制作过程

图三：三角瓶的包扎方法

3、分组配制培养基

（1）配制高氏一号培养基300ml。（培养放线菌）

配方：可溶性淀粉20g  NaCl 0.5g、KNO3 1g 、K2HPO4·3H2O 0.5g  MgSO4·7H2O 0.5g  

FeSO4·7H2O 0.01g   琼脂 15-25g  水 1000ml  pH 7.4-7.6

（2）配制牛肉膏蛋白胨培养基500ml （培养大肠杆菌）

配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g  NaCl 5g  加水定容至1000ml  调PH 至7.4-7.6

其中300ml培养基倒入500ml的三角锥形瓶 + 6g琼脂，包扎待灭菌后用来倒平板、斜面。

其余200ml液体培养基平均分装入4个锥形瓶，包扎待灭菌。

（3）YPD培养基1000ml （培养酵母菌）

配方：酵母膏10g，蛋白胨20g ，葡萄糖20g，加水定容至1000ml，调pH至5.0

其中500ml培养基平均分装至500ml的三角锥形瓶 + 2%琼脂，包扎待灭菌后用来倒平板。

其中200ml培养基平均分装至500ml的三角锥形瓶 + 2%琼脂，包扎待灭菌后用来倒斜面。

其余300ml液体培养基平均分装入4个锥形瓶，包扎待灭菌。

（4）包扎材料：试管，培养皿，涂布棒，吸管，枪头盒等。

（5）灭菌。

（6）摆斜面，倒平板，放冰箱。

4、方法步骤

（一）培养基的制备与分装

①称量 按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。

②熔化 在沸水浴锅中加热熔化。

③调pH

④过滤 趁热用多层纱布过滤 （这步一般不用，除去有大量不溶物）

⑤分装 将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。

⑥加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。

⑦为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。

（二）高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌。

高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103－206kPa时，湿度可达121.3-132℃。高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌，为目前可靠而有效的灭菌方法。适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。

操作方法：

①在灭菌锅中盛蒸馏水直至高水位灯亮；将用试管分装好的培养基、包装好的培养皿等玻璃器械放入灭菌器内；

②旋紧上盖，设定灭菌条件：103kPa，121.3℃，开始灭菌；

③加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气5分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3℃，维持20分钟后，排气至压力显示“0”时，慢慢打开盖子。如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。

（三）倒平板、摆斜面

①灭菌完毕，将试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

②在超净工作台上将三角瓶中无菌培养基倒入无菌培养皿中

③将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。

④将培养基放入4℃冰箱待用。

五、注意事项：

高压蒸汽灭菌法：

第一，无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。

　　第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。

第三，定期检查灭菌效果。经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜。

超净工作台的使用：无菌，整齐。

五、实验报告

成果拍照

六、思考题

1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？

2.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么？

3.配制培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意些什么问题？为什么？

第二篇：《培养基的制备与消毒灭菌》 实验报告

《培养基的制备与消毒灭菌》 实验报告

实验目的

1.学习和掌握配制培养基（以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例）的一般方法和原理。

2.了解消毒和灭菌的原理，掌握常用灭菌方法的操作步骤。

实验原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中．微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对PH要求不一样．雷菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌．如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

高压蒸气灭菌是将持灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀．继续加热，此时由于蒸气不能道出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下而垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：

牛肉膏 3.0g

蛋白胨 10.0 g

NaCl 5.0g

水 1000ml

pH 7.4—7.6

实验仪器与药品

1.溶液或试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol／L NaOH、1mol／L HCl。

2.仪器或其他用具：试管、三角瓶、1000ml烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH 5.5-9.0）、普通棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布等。

实验步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备

1.称量（假定配制1000ml培养基）

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放人水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

2.溶化

在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

3.调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸．用滴管向培养基中逐滴加入1mol／LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其PH，直至pH达7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl进行调节。

4.过滤

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。可以省去(本实验勿需过滤)。

5.分装

液体分装

分装高度以试管高度的1／4左右为宜。分装三角瓶的虽则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。

固体分装

分装试管，其装量不超过管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。

半固体分装

一般以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

6.加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅胶塞、金属或高温塑料试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内面造成污染，并保证有良好的通气性能(棉塞制作方法附本实验后面)。

7.包扎

加塞后，将全部试管放入铁丝筐或用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、配制日期。

8.灭菌

将上述培养基以0.103MPa，l21℃，20min高压蒸气灭菌。

9.摆斜面

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜

l0.无菌检查

将灭菌培养基放入37℃的恒温箱中培养24-48h．以捡查灭菌是否彻底。

注意事项

1.蛋白胨很容易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称量时严防药品混杂．一把牛角匙用于一种药品．或称取一种药品后，洗净——擦干——再称职另一药品——瓶盖也不要盖错。

2.在琼脂溶化过程中．应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。

3.对于有些要求PH较精确的微生物，其PH的调节可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时．若预先记好PH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。

4.分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。

（二）高压蒸汽灭菌法步骤

1.加水

使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。水面与三角架相平为宜

2.装料

将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。

3.加盖

盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。

4.加热排气

加热后水蒸气与空气一起从排气孔排出，待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，排出的气流很强并有嘘声时，维持2—3min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。

5.加压

将排气阀关闭

6.保压

当压力升至0.1MPa时，温度达121℃，此时应注意观察，控制热源。保持压力稳定，维持20-30min后，切断热源。

7.自然降压

当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。压力降到“0”时，方可打开排气阀。

8.保养

灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。

9.培养基无菌检查 五、关键步骤及注意事项

1.要严格按配方配制。

2.调pH不要过头。

3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70?C以下放物、取物。

4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。

5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。

陕西师范大学远程教育学院

生物学实验报告

报告题目 《培养基的制备与消毒灭菌》

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指导教师 学习中心 实验报告