药敏试验方法：

默认分类 2009-05-06 22:37 阅读285 评论0

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K-B法：

1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单

位。

2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤

出过多的菌液。

3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接

种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。

4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个

纸片中心间距24mm。纸片一旦与平板接触，不应再移动。

5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。

6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。

说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-

B法.

肺炎链球菌胶乳凝集测定法

1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。

2 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。

· 3 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。

4 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。

5 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。

注：R3为阳性对照。

药敏纸片的选择

1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）

头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）

氨苄西林（AM） 哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）

头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM）

庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）

头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）

奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）

亚安培南 头孢匹肟（FEP） 头孢克罗（CEC）

2、铜绿假单孢菌/不动杆菌

妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）

头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟

头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ）

左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南 哌拉西林/三唑巴坦

3、金黄色葡萄球菌

苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）

红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）

万古霉素 奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦

头孢噻吩（CF）

4 、肠球菌

氨苄西林（AM）万古霉素 环丙沙星（CIP）

庆大霉素（GM）红霉素（E） 氧氟沙星（OFL）

5、除肺炎链球菌外链球菌

氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素

红霉素（E） 氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)

肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测

MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。

如头孢他定的抑菌圈<22mm，安曲南<27mm，头孢噻肟<27mm，意味可能有ESBLS产生。

如头孢他定/克拉维酸与头孢他定，头孢噻肟/棒酸与头孢噻肟的差值≥5mm，则确证ESBLS产生。

耐药机制。

一代头孢对普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、肠球菌、假单孢菌属、沙雷氏菌属、拟杆菌属无效。第二代头孢对假单孢菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属、肠球菌无效；肠球菌对头孢类天然耐药。氨基糖甙类抗

生素阿米卡星与庆大霉素不完全交叉耐药。红霉素类、四环素类等抗生素内部有相互交叉耐药。 金黄色葡萄球菌耐万古霉素、无乳链球菌耐青霉素和氨苄青霉素、无乳链球菌和D群链球菌耐万古

霉素和替拉考宁为不可能的表型。

洋葱伯克霍德菌对氨基糖甙类、亚安培南天然耐药。

除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考宁耐药的凝固酶阴性的葡萄球菌不常见。

金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药为罕见表型。

氨苄青霉素对非发酵类不宜应用。

对于葡萄球菌，苯唑西林耐药，青霉素敏感是不可能的。

NCCLS关于细菌药敏实验的说明

总评论：1、头孢噻吩可以代表头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、和头孢羟氨苄。但是，头孢唑林、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢丙烯应单独测试，因为某些对这些药物敏感的菌株对头

孢噻吩是耐药的。

2、 利福平不能单独用于化疗。

肠杆菌科

1对于沙门菌属和志贺菌属只有氨苄西林、喹诺酮、和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑可用于常规试验与报告。初此之外，对于沙门菌属和志贺菌属的肠道外分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。

2、克雷伯菌属和大肠艾希菌的产ESBLS株对青霉素、头孢菌素类或安曲南临床治疗可显耐药性，尽管在体外药敏试验对其中某些抗生素敏感。对于所有产ESBLs株，应报告为耐所有青霉素类、头孢菌素

及安曲南。

3、随着3代头孢菌素的治疗，肠杆菌属、枸橼酸菌属和沙雷菌属可发展其耐药性。最易敏感的菌株

在开始治疗3-4天就可变为耐药，因此要反复测试这些菌株。

葡萄球菌

1、 青霉素敏感的葡萄球菌对FDA批准的用于葡萄球菌感染的其他青霉素类、头孢菌素和碳青烯类也是敏感的。青霉素耐药而苯唑西林敏感的菌株对β-内酰胺酶不稳定的青霉素是耐药的，但对其他β-内酰胺酶稳定的青霉素、β-内酰胺酶抑制剂复合药、相关的头孢类和卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐药的葡萄球菌对现在可用的所有β-内酰胺类抗生素是耐药的。因此仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知一大批β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药性，不必常规测试其他青霉素类、β-内酰胺类抑制剂复合药、头孢类和卡

巴陪南类。

2、 绝大多数的MRS对多种抗生素耐药。包括β-内酰胺类、氨基糖甙类、大环内酯类、克林霉素和

四环素。观察到多重耐药应该是对甲氧西林可能耐药的线索。

3、 长期应用喹诺酮类治疗的过程中葡萄球菌可发展其耐药性，因此应重复测试耐药性。

肠球菌

1、 对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖甙类（除了筛选高水平耐药性）、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺

甲恶唑在体外可能有活性，但临床无效，因此不能报告细菌对这些药物敏感。

2、 青霉素敏感性可以用于不产β-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄

西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性

3、 氨苄西林是氨苄西林和阿莫西林类的代表药。氨苄西林的结果可用来判断不产β-内酰胺酶的肠

球菌对阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦的敏感性。

4、 青霉素的结果可预测不产β-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫

西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦的敏感性。

5、 对于血和脑脊液分离株需用头孢硝噻吩β-内酰胺酶试验，阳性提示对青霉素耐药，同时对酰胺

基、羧基和脲基青霉素耐药。

细菌鉴别要点

1、 革兰阳性球菌

所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。

通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌，阴性为链球菌科。但不排除例外，气球菌为弱阳性。粪肠球菌偶有阳性。操作触酶试验应尽量避免用铂金取菌环（针）在H2O2 上涂菌，而应先涂菌，在滴H2O2，步骤不能颠倒。因为铂金可以和H2O2产生假阳性反应。H2O2必须新鲜，若放置过久或暴露于光线下容易

分解，必须保存于4℃冰箱。实验所用菌须大量，不可挑到琼脂，会产生假阳性。

对触酶阳性的革兰阳性球菌，应继续做玻片法血浆凝固酶试验，此为检出葡萄球菌，如阳性一般为金黄色葡萄球菌；如阴性应做试管法凝固酶实验确证，玻片法仅为筛选实验。血浆凝固酶实验用血浆须用兔或猪血浆，新鲜血浆不稳定，可能发生自我凝集或形成颗粒产生浑浊或产生沉淀而导致判度错误；不可

使用人血浆，其含有抑制物质回干扰实验结果。

触酶阴性为链球菌科，根据菌落溶血进行下一步鉴定。а溶血：草绿色链球菌；肺炎链球菌；肠球菌

в溶血：A群链球菌；B群链球菌，部分D群链球菌

肠球菌也有不溶血菌落，不能根据溶血判断肠球菌。链球菌主要实验：胆汁七叶苷，七叶苷，菊糖，

CAMP ，杆菌肽，高盐，奥朴托辛，胆盐溶解。

肠球菌为致病菌，且肠球菌与非肠球菌耐药机制不同，应进行鉴别，肠球菌分为粪肠球菌和屎肠球菌；非肠球菌分为牛链球菌和马链球菌。肠球菌对青霉素耐药，非肠球菌对青霉素敏感。肠球菌的药敏注

意高耐氨基糖甙的细菌，如高耐氨基糖甙则意味氨基糖甙与в内酰胺类药物合用无协同作用。

肺炎链球菌与草绿色链球菌鉴别：肺炎链球菌奥朴托辛、菊糖、胆盐溶解实验皆为阳性。但这3个实验都非特异，需联合应用方为最佳。肺炎链球菌的青霉素药敏实验应注意，当青霉素（K-B法）的抑菌圈直径大于或等于19mm时为敏感，当小于19mm时不能确定是否中敏或耐药，应做MIC稀释确证。

2、 革兰阴性杆菌

包括肠杆菌科、非发酵菌和弧菌科。

第一步实验为氧化酶实验。

氧化酶阴性为肠杆菌科；阳性为非发酵菌和弧菌科。

肠杆菌科包括大肠杆菌、变形杆菌、普罗菲登斯菌及摩根菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、

沙雷菌属、耶尔森菌属。非发酵菌包括铜绿假单孢菌、黄单孢菌、不动杆菌等。

氧化酶实验注意事项：①需用铜绿假单孢菌做阳性对照。

②60秒内判读结果有效，而以10秒内最佳。③不要用含微量铁的取菌环或针，可用棉棒替代。

革兰阴性杆菌的鉴定以API系列为国标，其他生化管仅为常规鉴定。

第二篇：一种快速药敏试验方法

２００７年第

２９卷第１６期ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙＶｏｌ．２９，Ｎｏ．１６．２００７

一种快速药敏试验方法

廖诗英，王明成，杨玉容（黄淮学院，河南驻马店４６３０００）

由于滥用抗生素和饲料中长期添加低剂量的

抗生素，导致细菌的耐药性越来越普遍、越来越严

重，仅凭以往的经验用药往往无效，因此药敏试验

显得至关重要。然而传统的纸片法药敏试验耗时较

长不能适应临床治疗的迫切性，在一定程度上也限

制了药敏试验的普及。如何在不降低试验准确性的

同时缩短药敏试验的时间，以便于及时选用有效的

抗菌药物控制病情，是广大养殖场和基层兽医站的

迫切期望。为此，我们在改进传统药敏试验的基础

上，设计了一种快速、简便的ＴＴＣ显色琼脂药敏试

验方法，并在临床药敏试验中取得了理想的效果，

现介绍如下。２．１．２药敏片的制备细菌药敏试验中使用的药敏片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：取新华１号定性滤纸，用打孔器打成６ｍｍ直径的圆形小纸片。取圆纸片５０片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经１５磅１５～２０ｍｉｎ高压消毒后，放在３７℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为０．０１ｍＬ计，在上述含有５０片纸片的小瓶内加入药液０．５ｍＬ，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡３０ｍｉｎ即可。同时在瓶口上记录药物名称，放３７℃温箱内过夜，干燥后即密盖。

置阴暗干燥处存放，有效期４～６个月。

药液的制备：抗菌药的稀释剂通常用无菌的蒸

馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水

浓度，按１ｇ需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就

相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如５ｇ药物可

配５０ｋｇ饲料，其换算方法为：１ｇ本品加１００００ｍＬ

蒸馏水。此溶液即为用于做药敏试验的药液。如所

加蒸馏水量较大，可按倍比稀释法稀释。１原理与传统纸片法在普通琼脂上进行药敏试验不同，本方法使用的是含０．００５％２，３，５－氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）的显色培养基，细菌在生长繁殖过程中可产生琥珀酸脱氢酶，使无色的ＴＴＣ还原为红色物质（三苯基甲替），使培养基变红；而药敏片周围有抗菌素存在抑制了细菌的繁殖，ＴＴＣ指示剂不被还原、不显色，形成对比鲜明的抑菌圈，所

以能较早判读抑菌圈的大小。２．２试验操作方法

在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或２材料与方法

２．１材料

２．１．１ＴＴＣ显色琼脂培养基的制备

先按常规法制作普通琼脂培养基，再按１００ｍＬ

琼脂加入０．５ｍＬ１％ＴＴＣ溶液，１０磅３０ｍｉｎ灭

菌后，倾注于平皿中备用。经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌均匀涂布到ＴＴＣ显色琼脂培养基上。然后用无菌镊子取药敏片贴到平皿培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。再置于３７℃温箱中培养３～４ｈ，观察记录结果。以

药敏纸片周围无色区域为抑菌圈，根据抑菌圈直

径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。１％ＴＴＣ溶液：称取０．１ｇＴＴＣ，溶于１０ｍＬ灭菌蒸馏水中，装入褐色瓶内于７℃冰箱保存。

注意：ＴＴＣ不能存放太久，如遇溶液变色，

则不能再用。

收稿日期：２００７－０７－１７２．３结果判定按照常规药敏片扩散法标准进行判读。判定标准见表１。

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２００７年第

２９卷第１６期ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙＶｏｌ．２９，Ｎｏ．１６．２００７

经验交流

表１

抑菌圈直径（ｍｍ）常规药敏片扩散法标准敏感性

极敏

高敏

中敏

低敏上进行的，没有颜色变化，只有细菌在琼脂表面集中生长形成菌苔后，肉眼才能观察明显，故需时间较长，一般为１６ｈ以上。而ＴＴＣ显色琼脂药敏法是在显色培养基上进行的，只要有细菌生长，培养

基中的ＴＴＣ指示剂就由无色变成红色，因此形成

肉眼可见抑菌圈所需的时间短，绝大多数菌株在＞２０２０１５～１０～１４＜１０３应用

２００６年５月～２００７年６月，笔者曾对驻马店

各养殖场临床检出的１７６株细菌同时用ＴＴＣ显

色琼脂药敏法和常规药敏片扩散法进行药物敏感

试验，并且用这两种药敏方法对标准菌株进行２０

次检测。结果１６９株细菌用ＴＴＣ显色琼脂药敏法

在４ｈ内获得结果，占９６．０％，与常规药敏片法敏

感度完全相同或基本相同的有１６８株，占９５．４％。

对标准菌株进行的药敏试验，两种方法取得的抑

菌圈直径没有显著性差异。４ｈ内可获得结果，且抑菌圈呈圆形无色，细菌生长部分为鲜红色至紫红色，对比强烈，结果极易观察和判断。通过对比实验得出，ＴＴＣ显色琼脂药敏法药物敏感度和常规药敏片扩散法基本一致，而且选用标准菌株时抑菌圈二者没有显著差异，因此结果可靠，同时操作简单，无须增添特殊设简便、容易判读的特点，作为一种快备，具有快速、速的药敏试验方法，可帮助临床兽医和畜禽养殖者及时选用有效抗菌药治疗畜禽疾病，特别适合

各养殖场和基层兽医站推广使用。４讨论

由于常规药敏片扩散法是在普通琼脂培养基

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第４０页）表１

日龄３］用［１～，活化免疫器官，提高Ｔ、Ｂ淋巴细胞功能，单核巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的吞噬能力，促进抗体生单核细胞、嗜酸性粒细胞吞噬指数组别单核细胞嗜酸性粒细胞成等多种功效，尤其是多糖的免疫活性最为突出，它可从多个层面发挥免疫增强作用，既可增强机体

的特异性免疫，又可增强机体的非特异性免疫；既

可增强正常机体的免疫功能，又可调节机体异常的

６］免疫功能［４～。寻找高效安全的免疫增效剂，是近年２２１％０．５％对照３２１％０．５％

对照

４２１％０．５％

对照

５２１％０．５％

对照

６２１％０．５％

对照１．９７１．９０１．７９２．８１２．７１２．６０３．４３３．３３３．１５３．５１３．４２３．２７３．４８３．３９３．２９１．８３１．７７１．６９２．２３２．２５２．１０３．１７３．１０２．９０３．４４３．２３３．０８３．４１３．３０３．１７来医学和生物学领域研究的一个重要课题。中草药作为绿色天然植物，相对于化药免疫增强剂而言，无毒副作用，无残留污染。因此，中草药免疫增效剂将是今后畜禽免疫增效剂研究的趋势。参考文献：１剡根强，谷新利，王玮等．中草药免疫增效剂对雏鸡免疫功能的影响［Ｊ］．养禽与禽病防治，１９９８，４：１１－１２．

党参、茯苓、白花蛇舌草等富含黄酮、多糖等成分

的多种中草药，依据现代中医中药理论，科学组方

配伍，并通过不同剂量给鸡在日常饮水中添加，研

究中草药免疫增强剂对鸡免疫细胞的促进作用。

结果表明，“疫佳灵”在１％浓度给药，在４２～５２日龄

时对鸡免疫细胞的促进作用最明显，单核细胞，嗜

酸性粒细胞的数量及吞噬能力有明显提高。２陈德坤，李俊生，张宝川等．复方中草药提取物在新城疫Ｂ１株免疫中的免疫增强作用［Ｊ］．动物医学进展，１９９８，３：３１－３２．３张庆茹．中草药免疫促进作用的研究进展［Ｊ］．中兽医医药杂志，１９９７，５：１５－１６．４滑静，吴际舟，杨佐君．中草药添加剂对小公鸡增重和免疫器官的影响［Ｊ］．当代畜牧，１９９８，１：２８－２９．５朱瑞良．中草药与动物免疫［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９４，２８（３）：３．２关于中药“疫佳灵”的有效成分

黄芪、党参、白花蛇舌草等含有黄酮、多糖、皂５１－５４．６贾泰元，ＢｅｎｊａｍｉｎＨ．Ｓ．Ｌａｕ．党参对鼠Ｊ７７４巨噬细胞吞噬活性的甙等生物有效成分，这些物质具有促进免疫功能作增强效应［Ｊ］．时珍国医，２０００，１１（９）：７６９－７７０．

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