实验三 PCR扩增

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一、实验目的

复习PCR扩增的原理，熟悉PCR的操作流程。

二、实验原理

PCR，即聚合酶链式反应，是一项在体外、短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

PCR包括三个过程：

（1）、变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；

（2）、退火：两种寡核苷酸引物在适当温度(50~60℃)下与模板上的目的序列通过氢键配对；

（3）、延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验仪器及材料

PCR扩增仪，微量移液器（0.1~2.5μL、0.5~10μL、10~100μL三种），Tip头，0.2ml薄壁管，1.5ml离心管，Taq DNA 聚合酶，dNTP，buffer，引物（341FGC和534r），16S全长DNA样本。

四、实验步骤

1、用微量移液器分别取194μLddH2O、25μL Buffe、10μL dNTP、5μL 341FGC引物、5μL 534r引物及12.5μL Taq DNA聚合酶于1.5ml离心管中，混合均匀后分装到9个0.2ml薄壁管中，每支管加入24μL混合液。

2、向第1~8支薄壁管分别加入1μL样品模板，第9支管加入1μL无菌水做阴性对照。在薄壁管的盖子上写上组号及样品编号。

3、将9支薄壁管放入PCR扩增仪中，设置好扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 30s；72℃ 5min；15℃。循环次数30~40。设置好后启动扩增仪，开始扩增。

4、将扩增的好的样品按下述步骤进行电泳实验：

（1）、取0.2g琼脂糖和20ml 0.5×TAE于锥形瓶中，放置微波炉中加热2min左右，至混合液透明，取出室温下冷却。将混合液倒入FR-180E制胶器的槽中，插入孔刷，注意不要有气泡。冷却一段时间，等胶凝固。

（2）、取10μL Loading Buffer染液，在铺平的塑料手套上均匀分成9份，再取4μL PCR产物与染液混匀。将10μL移液器调至6-7μL，依次吸取上述混合液滴，分别加入到1-9号胶孔中，第10号胶孔中加入4μL的DL 2000 TM DNA Maeker。

（3）、将胶整个放入装满0.5×TAE的电泳槽中，通100V电压。

（4）、电泳半小时左右，可明显看出染液移动。将胶至于分析仪器内，在紫外灯照射下，得到电泳图并拍照。

五、实验结果与讨论

1、此次实验结果是什么？（请附图）所得到的实验结果该如何解释？

答：此次实验结果如下图所示。

图中，1-8号为待测样品，9号为阴性对照，10号为DNA Marker。

从电泳结果可以看出，3-6号样品对应Marker的250bp左右处有明显的亮带，说明3-6号样品的PCR扩张很好。2号样品在250bp处条带较微弱，说明扩增效果不是很好。而1、7、8号样品，在250bp左右基本无亮带，说明扩增实验出错，可能是因为模板没取到或者移液器枪头在加样时未深入液面下加入而引起的。9号为阴性对照，在250bp处无亮带，说明效果良好，实验过程中无环境（ddH2O）污染。

2、实验过程中需要注意些什么细节？

答：（1）、无菌盒内的离心管和薄壁管应用带枪头的微量移液器挑出，防止污染盒内其他管。

（2）、配制反应体系时，由于不同样品除了模板不同，其余试剂的加入量均相同，所以可以先在离心管中配制总体系（除模板DNA外的其他试剂均加好），混匀分装到薄壁管后，再向个管内加模板DNA。这种方法比较节约时间。

（3）、上述方法配制总体系时，应考虑取样损失及误差，多配一些（如8个样品，1个阴性对照，可以按10个样品的量配制）。

（4）、用微量移液器移取液体时，由于移液量很少，所以每次应将枪头插至管底将液体打出。

（5）、PCR仪存在边缘效应，即样品板的周围即角落处受热较差，中间区域受热较好，所以当样品数目不多时，尽量放在样品板中间区域。

3、通过这个实验你有什么收获？

答：通过PCR扩增实验，我对PCR扩增理论有了更深入的认识，而且学到了配制反应体系时的很多细节。同时，我还学会了PCR扩增仪的参数设置及使用，通过老师的讲解，我还了解了PCR扩增仪的一些特殊模式，如touch down以及分块设置退火温度等。

六、思考题

1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？（提示NCBI有大肠杆菌全基因组序列）

答：（1）、现在NCBI数据库中找到大肠杆菌的全基因序列；

（2）、从全基因序列中找到需要扩增的那个酶的基因片段；

（3）、通过引物设计软件来设计PCR扩增所需的引物；

（4）、得到目的基因和引物后，通过常规PCR扩增实验来进行扩增。

（5）、扩增后结果可以通过电泳实验进行分析。

2、一对引物序列为5‘-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3’和

5‘-ACCAGTGTCGACACCGCTCA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？

答：对于引物序列5‘-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3’，

Tm1=4（G+C）＋ 2（A+T）=4*（3+8）+2*（5+4）=62

对于引物序列5‘-ACCAGTGTCGACACCGCTCA，

Tm2=4（G+C）＋ 2（A+T）=4*（4+8）+2*（5+3）=64

Tm1＜Tm2，则 退火温度=Tm1-5=62-5=57℃。

如果按照次退火温度没有得到相应的产物，可以做一个退火温度优化实验，即用touch downPCR或分模块设置退火温度，看不同温度下的PCR扩增量，选择扩增最好的作为退火温度。

第二篇：PCR扩增实验

1、PCR扩增试验原理：利用特异的引物，以重组质粒pGEX-4T-1〔His〕6-C-X为模板扩增X基因。n扩增反应1〕扩增引物2〕模板：重组质粒pGEX-4T-1〔His〕6-C-X3〕PCR反应试剂盒〔购置〕4〕50×TAE缓冲液：242gTris碱57.1ml冰醋酸100ml0.5MEDTAH2O补充至1000ml5〕6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖，4℃保存6〕溴化乙锭保存液：10mg／ml，避光保存7〕0.8％琼脂糖凝胶：0.8克琼脂糖加热溶于100ml1×TAE。1.材料

2、n1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：(100ul)ddH2O79ul10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物，2ul(终浓度为0.2mmol／L)MgCl26ul(终浓度为1.5mmol／L)引物11ul(终浓度为50pmmol／L)引物21ul(终浓度为50pmmol／L)模板DNA1ul2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发

3、。2.操作步骤n5〕按以下方法进行PCR反应：常用循环参数：①变性：94℃1分钟、②退火：55℃1分钟、③延长：72℃1分30个循环。6)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；7)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE缓冲液，使液面略高于凝胶。8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2ul并加1ul6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。9)电泳100V约1小时；10)在500ml水中加入溴化乙锭保存液,(EB终浓度0.5-1ug/ml)

4、,混匀；11)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟；12)取出凝胶，用水稍漂洗；13)紫外灯下确定DNA区带。n由于PCR能够使DNA分子大量扩增，所以应当留意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi，1989)。尤其在待扩增靶序列浓度低的状况下，更有必要实行防范措施。留意事项n1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活

5、塞的正向排液式移液器。全部缓冲液、吸头和离心管使用前必需经过高压处理。2)预备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立特地位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。n3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，削减污染的机会。4)加完全部其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作

6、瞬时离心(10秒)，使水相和有机相分开。n5)将模板DNA加入PCR系统时，留意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。6)应设置阳性对比反应(即由少量适当的靶序列参加的PCR)。对靶序列的稀释工作应于试验前在试验室内别的位置进行，防止将靶DNA的浓溶液带到试验室中特地进行PCR的位置。7)必需设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中全部其他成分的对比反应，这一对比管须在预备好全部其他PCR以后才进行吸加。附PCR试验动画