生物化学实验报告
姓 名： 王晨阳
学 号： 3130101027
专业年级： 20##级临床医学（卓越创新班）
组 别： 第一实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
第二篇：生物化学实验报告 20xx
孝感学院生命科学技术学院实验报告
专业： 学号： 姓名： 分数：
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的与要求
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料 小麦面粉(1000 g)
2．主要仪器
（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL×2
（4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计
3． 试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。
（3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。
（5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL）
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
批阅教师： 年 月 日
取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540 nm，用0号管调零点，等后面7~10号管准备好后，测出1～6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
葡萄糖标准曲线
2. 样品中还原糖和总糖的测定
（1）还原糖的提取
准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL蒸馏水，搅匀，置于50 ℃恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
（2）总糖的水解和提取
准确称取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100 mL，过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
（3）显色和比色
取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出7～10号管的光密度值。
表2 样品还原糖测定
五、结果与计算
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。
六、注意
1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。
2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。
七、思考题
1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？
3. 绘制标准曲线的目的是什么？
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实验二 油脂酸价的测定
一、目的与要求
初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。
二、实验原理
油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。
酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。
三、主要仪器、实验材料和试剂
1. 锥形瓶（250 mL）3个； 2. 量筒（50 mL）1支；3. 碱式滴定管1支；4. 花生油、菜油、芝麻油等；5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；6. 0.1 ％ KOH（1克KOH溶于1000 mL纯水中）。
四、操作步骤
1. 准确称取1~2 g油脂于250 mL锥形瓶中。
2. 在瓶内加入乙醇－乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。
待油样完全溶解后，加入1％酚酞指示剂3～5滴，立即用0.1％ KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。
酸价＝2(V2-V1)/W
V2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数
V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数
W：油样重(g)
注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。
五、实验结果
六、思考题
请对你的实验结果进行分析。
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实验三蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)
一、目的与要求
掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 试验材料：萌发3天的小麦种子
2. 主要仪器
（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6）100 mL容量瓶
3．试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。
四、操作步骤
1．蛋白质（淀粉酶）的提取
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。
2. 标准曲线制作
按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。
批阅教师： 年 月 日
表1 蛋白质标准曲线制作
3.样品测定
取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。
蛋白质浓度=
五、思考题
1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？
2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？
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实验四淀粉酶活力的测定
一、目的与要求
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。
二、实验原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70 ℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1
（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管×13（8）试管架（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 （10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
批阅教师： 年 月 日
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：
表1 麦芽糖标准曲线制作
摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10 mL，放入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
3．酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表2 酶活力测定取样表
将各试管摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管（做标准曲线时用过的）作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度，记录测定结果。
五、结果计算
计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。
＝
计算Ⅱ- 5、Ⅱ- 6光密度平均值与Ⅱ- 4光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力(单位同上)。
（α＋β）淀粉酶总活力
＝
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力＝
六、思考题
1．为什么要将Ⅰ- 1、Ⅰ- 2、Ⅰ- 3号试管中的淀粉酶原液置70 ℃水浴中保温15min？
2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40 ℃水浴中保温？
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实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
一、目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。
二、原理
带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳有很多类型，如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。
不同的质点在同一电场中泳动速度不同，据此可将不同带电物质分开。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材及试剂
1．器材：
2．试剂：
①巴比妥缓冲液（PH8.6）：巴比妥2.76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000毫升。
②染色液：氨基黑10B 0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复用）。
③漂洗液：含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。
④透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。
四、操作步骤
1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在无光泽面角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。
2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。
批阅教师： 年 月 日
3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。
4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。
5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带
清晰的电泳图谱。
6．定量（了解）：有两种方法
（1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于4.0ml 0.4mol·L-1NaOH溶液中（37℃）5—10分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：OD白、ODα1、ODα2、ODβ、ODγ。则光密度总和（OD总）为：
OD总=OD白+ODα1+ODα2+ODβ+ODγ
白蛋白%=
×100 α1球蛋白%=
×100 α2球蛋白%=
×100
β球蛋白%=
×100 γ球蛋白%=
×100
（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约5—10分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。
五、思考题
1．点样端为何放在负极？
2．实验中应注意哪些事项？
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实验六 氨基酸的分离鉴定――纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：
Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到容剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、小烧杯 6、长颈漏斗7、层析滤纸(新华一号) 8、电吹风
四、试剂
1、扩展剂 正丁醇:88%甲酸:水＝15:2.5:2.5（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制40 mL。
2、氨基酸溶液 0．5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0．5％)。
3、显色剂 50～l00 mL 0.1％ 水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1．将盛有扩展剂10 mL的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。
2．戴手套取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘2～3 cm处用铅笔划一条直
线，在此直线上每间隔2.5 cm作一记号。
3．点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后重复点一次，直径最大不超过3 mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约10~30分钟。
4．展层 用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。溶剂扩展至滤纸上沿约5厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。
5．显色 用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有α－氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。
批阅教师： 年 月 日
6．计算各种氨基酸的Rf值。
六、实验结果
各种氨基酸的Rf值：
七、思考题
1. 实验过程中切勿用手直接接触滤纸和显色剂，为什么？
2. 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为什么？
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实验七 基因组DNA的快速提取---碘化钾法
一、实验目的
了解碘化钾法提取动物组织基因组DNA的原理；掌握DNA提取的相关操作技术。
二、实验原理
快速、经济地从血液、组织或培养细胞中得到高产量、高纯度的DNA 对于基因研究非常重要。
目前国内外基因组DNA 的提取方法有传统的蛋白酶K 消化法、尿素法、氯化锌法、辛酸法等， 这些方法存在操作步骤繁杂或者使用蛋白酶，且国内许多实验室不易得到方法中使用的试剂。 高浓度碘化钾可直接将细胞膜、核膜破坏、使DNA 释放出来，然后用异丙醇沉淀DNA。实验表明，KI 的浓度对DNA 的提取效率有影响，5 mol/ L 的KI 提取DNA 效果较好。
KI 法操作简便，不用价格较高的蛋白酶K。DNA 丢失少。该方法提取的DNA 与经典的蛋白酶K 法提取的DNA 比较电泳结果基本一致。
三、实验材料、试剂及主要器材
1. 实验材料
冷冻的新鲜动物肝脏。
2. 试剂
氯仿/异戊醇（24∶1）:异戊醇21 mL加入到500 mL的氯仿试剂瓶中，混匀；5 mol/L 碘化钾：（41.5克碘化钾溶于50 mL纯水中）；0. 9 % NaCl：4.5克NaCl溶于500 mL纯水中；无水乙醇。
3. 主要器材
台式高速(冷冻)离心机、移液器（10, 100，1000 µL），旋涡混合器、Eppendorf管等。
四、实验步骤
1. 取黄豆粒大小冷冻肝组织于EP管中（EP管上写上自己学号的最后两位数），有眼科剪捣碎；
2. 加50 µL 5 mol/ L KI，旋涡振荡30 s，静置3 min；
3. 加0. 9 % NaCl 375 µL，氯仿/异戊醇(24:1) 600 µL，充分振荡10 min，10 000 r/ min 离心5 min ；
4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇1000 µL，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；
5. 加冷无水乙醇1000 µL，12，000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37 ℃烘干约10 min）；以50 µL无菌双蒸水溶解DNA ，备用。
2. 加50 µL 5 mol/ L KI ，旋涡振荡30 s，将沉淀物混匀3 min；
3. 加0. 9 % NaCl 250 µL，氯仿/异戊醇(24∶1) 375 µL，充分振荡10 min ，10 000 r/ min 离心5 min ；
4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇（-20度）300 µL，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），-20度冰箱静置5 min后12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；
批阅教师： 年 月 日
5. 加冷无水乙醇1000 µL，12，000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37℃烘干约10 min）；以50 µL无菌双蒸水溶解DNA ，备用。
五、思考题
1）在DNA 提取过程中乙醇的作用是什么？为什么用-20度预冷的乙醇效果更好？
2）实验所用的EP管和枪头等需要高温灭菌吗，为什么？
孝感学院生命科学技术学院实验报告
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实验八 琼脂糖凝胶电泳技术――DNA样品检测
一、实验目的
学习与掌握琼脂糖凝胶电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量以及分子量，分离不同大小DNA片段。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。
三、试剂配制
1. 5×TBE：Tris 54g；硼酸27.5g；0.5 M EDTA（pH 8.0）20 mL；加双蒸水至1 L。用时5倍稀释。
2. EB：用水配制成10 mg/mL的贮存液，分装，避光，4℃保存（1g溴乙锭于100 mL水中）。
3. 6×加样buffer：0.25%溴酚蓝；40%（W/V）蔗糖；溶于水中，贮存于4℃。
四、实验操作
1. 胶模 水平放置胶模。
2. 制胶 量取200 mL 1×TBE 缓冲液倒入三角烧瓶中，称取1.6克琼脂糖加入，在微波炉上加热至全熔（清澈透明）。凝胶加热时间不宜过长，以免蒸干。
3. 倒胶 用琼脂糖封好胶模，待凝胶冷至50℃左右时（手感容器能耐受），缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在3～5 mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。
4. 凝胶条件 凝胶通常需要在室温中放置２0～30分钟。
5. 电泳缓冲液 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中（点样孔在负极），加入1×TBE电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1 mm。
6. 拔梳子 小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整。
7. 点样 用移液器取1-2 µL配制好的 Loading Buffer，分别与需要电泳的样品或Marker混合(5-10 µL)，点样，记录点样次序。注意：每次电泳每块胶需留一孔点DNA marker。加样时Tip头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的上方加样，样品会沉入孔内。
8. 电泳 开启电泳仪电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源。电泳起始时需采用低压（80～100V），待电泳几分钟后溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中，可调整电压至200V恒压电泳，当溴芬兰接近胶的先端，停止电泳。
9. 观测将胶在溴化乙锭（EB）溶液中浸泡约10分钟后，在用凝胶成像仪积分成像后观察并拍照。
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五、实验结果
DNA样品琼脂糖凝胶电泳检测图（在自己的点样孔上做上记号）。
六、思考题
1、如果实验成功了，请总结经验；如果实验失败了，请分析原因。
2、谈谈对生物化学实验的看法和建议。