分子生物学实验
预习指导
总学时／周学时： 45 / 3 开课时间： 14-15 学年 第 1 学期 第 9 周至第18周 授课年级、专业、班级： 使用教材： 《现代分子生物学实验技术》（2版）魏春红 授课教师： 邢建宏
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课程概述
一、关于本课程
地位与作用：随着分子生物学日新月异的发展，分子生物学实验技术已成为生命科学各学科重要的研究工具。本课程是在分子生物学理论课的基础上对分子生物学科研中常用的一些实验操作进行讲解，示范和练习，培养学生基本实验技能，提高学生独立思考、独立分析和独立解决问题的能力，使学生会正确的科研思维方法，养成严谨的科学作风。同时把同学们所学到的分子生物学理论知识和实验内容相结合的重要手段。为将来学习基因工程，生化工程，生物技术制药等课程打下基础。同时，通过本课程的学习还可以为学生将来从事生物技术方面的研究工作提供帮助。
先修课程：无机化学、有机化学、生物化学、分子生物学（理论课）、遗传学、普通生物学等相关课程。
总学时和总学分要求：新大纲课程总学时由原来的34学时增加为45学时，2.0
二、教学目的与要求
分子生物学实验课一方面使学生在实验中验证理论的来源与正确性、加深对理论的理解；另一方面，分子生物学实验手段又是生命科学发展的必用手段，因此分子生物学实验课是培养学生科研能力和素质的必要的、重要的过程。
根据生命科学的发展态势，结合本科生创新人才的培养要求以及我校生物技术专业本科生培养要求，希望通过分子生物学实验课程的教学与实践，达到以下目的：
（1）独立文献查阅与检索：学生应在了解实验背景和目的及基本内容后，学习和掌握文献资料的查阅、检索和应用，独立进行文献查阅与检索工作，完成实验方案的设计；
（2）自主实验研究：在巩固实验操作技能的基础上，学习实验研究技术。在指导教师的辅助与引导下，自主完成实验装置的装配、分析测定试剂配制与仪器准备；自主运行实验装置，掌握实验数据记录格式设计，记录数据整理与分析的方法；在指导教师的督导下，学习并实施相关大型分析仪器的分析操作。
（3）科学分析推导：要求学生学习和初步掌握对试验数据的科学分析讨论与推演方式。掌握依据实验结果推演到结论的思维过程，巩固所学的基础知识和相关专业知识，培养和提高科学研究能力。
（4）创新思维和能力的提高：通过整个实验研究过程，培养和锻炼发现问题、分 1
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析问题和解决问题的综合能力，主观能动性和创新思维和能力得到启发和提高。
三、教学内容与学时分配
章
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 合 计
教学内容
分子生物学实验室常用仪器设备的使用及实验安全 植物基因组DNA的制备与鉴定 植物总RNA的提取及其电泳鉴定 聚合酶链式反应扩增目的DNA片段 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 DNA重组 质粒DNA的提取
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量（选做） 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测（选做）
授课学时 实践学时 总学时
1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 12
1 5 5 3 5 5 5 6 5 6 46
2 6 6 4 6 6 6 8 6 8 58
四、课程教材和主要参考书
（一）教材：
魏春红主编，现代分子生物学实验技术（第二版），高等教育出版社，2012。 （二）主要参考书籍：
1、刘进元 张淑平，武耀廷 分子生物学实验指导 高等教育出版社，2006，第二版。 2、sandy primrose, Richard Twyan Bob Old 编著，瞿礼嘉，顾红雅 译《基因操作原理》（第6版），高等教育出版社2003-12；
3、胡晓燕等，生物化学与分子生物学实验技术，山东大学出版社，2005-1； 4、CornelMuelhardt著，分子生物学与基因组学，科学出版社，2007-7；
5、生物学基础实验教程-遗传学实验、生物化学实验、分子生物学实验(Ⅱ)，科学出版社，2008-6；
6、王晓华，等著，生物化学与分子生物学实验技术(普通高等教育十一五规划教材)/生物科学生物技术系列，化学工业出版社，2008-2。
7、屈伸，刘志国，主编，分子生物学实验技术，化学工业出版社，20xx年； 8、郝福英，朱玉贤等，分子生物学实验技术，北京大学出版社，19xx年； 9、J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2003
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年；
10、T.A.Brown.Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction(Fourth Edition)(影印版)，高等教育出版社。《基础生命科学》，吴庆余编著（清华大学），高等教育出版社，2002
五、本课程的教学方式与考核方法
（一）教学方式
在教学过程中，采取理论（教师讲解）－实践（学生独立实验）－理论（教师、学生共同讨论，得到提高）－综合实践（通过实验设计及实施）的方法。这种“理论－实践－理论－综合实践”的过程能使学生深刻理解分子生物学实验的技术与理论，能熟练运用已经学习的多种技术，学会充分利用本实验室已有的实验设备和条件，将自己的思想、想法付诸于实践。
突出学生自主创新能力培养。实验过程中由教师提出任务、学生在教师的指导、点评与讨论中完成实验设计方案，并在教师指导下，利用本实验室的各种条件完成自行设计的实验。以“基本技能训练＋自主实验设计＋教师指导下的探索性实验”的教学模式，充分发挥学生主观能动性，培养学生的创新意识和独立思考、独立解决问题的能力。
在教学评价上，本课程注重全面考查学生的素质，而不是仅仅考察学生所掌握的知识。考察的内容不仅有所学的知识和技能，还有运用知识的能力及实验中表现出的合作精神、认真与实事求是的科学态度等。考试方式一是通过学生的平时成绩。平时成绩包括实验技能、实验态度、实验室常识等的掌握和实验报告等方面。二是考核学生的独立实验设计和实践过程，注重学生的创新性思维及独立分析问题、解决问题能力的提高等。
（二）考核方法
实验成绩采用综合评定方法确定，成绩由平时成绩、实验成绩和期末成绩三部分构成。平时成绩占总成绩的30%：包括考勤、实验中表现及实验报告；实验成绩占总成绩的30%：采用现场考核；期末成绩占总成绩的40%：采用闭卷考试的方式进行。实验总分100分，实验成绩不及格者，本课程不予通过。
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分子生物学实验综合规程
? 上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次
没成绩；
? 请假须医院病假条或班主任签字的假条；
? 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿
拖鞋进实验室；
? 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验过程
中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。
? 必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并
按时提交实验报告；
? 公用试剂不得污染！每次都必须用新枪头。公用台上公用试剂不得私自
拿到自己实验台上；
? 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；
? 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。
? 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；
? 爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；
? 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；
? 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净 、摆
放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；
? 每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地
面等处卫生；
? 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师
声明；
? 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协
作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。
? 遵守通用的实验室规则。
违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。
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实验一 分子生物学实验室常用仪器设备的使用及实验安全
Unit 1 The Operating Technics for Instruments commonly
used in Experiments of Molecular Biology
一、实验目的
1.学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能。
2.掌握分子生物学中常用仪器设备（PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、冷冻离心机、超净工作台、纯水仪、生化培养箱等）的安全使用方法。
3.熟悉分子生物学实验中常用玻璃器皿、耗材。
二、实验原理
通过多媒体、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。
三、实验材料、仪器及用具
? 温度控制系统：冰箱：4 ℃、-20℃、-70 ℃--样品、试剂和材料等的保存
? 恒温培养箱：细菌平板的培养
? 恒温空气摇床；菌体的培养
? 灭菌器: 培养基、试剂、耗材等的灭菌
? PCR仪：PCR 扩增、保温实验等
? 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定
? 电泳仪：电泳时提供电压和电流
? 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架
? 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析
? 紫外分析仪：电泳结果的定性分析
? 台式高速冷冻离心机：样品的分离
? 分光光度计：样品的定量测定
? 超净工作台：提供洁净工作环境
? 电子天平：样品、试剂等的称量
? pH 计：精确的pH值测定
? 移液器；液体试剂的精确取量
四、实验方法与步骤
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1.学习分子生物学实验综合规程（见前页）
2.分子生物学基本技术
1）实验规范训练－仪器的操作
要求：
仪器在未经培训前，不得擅自使用
严格按操作规程使用仪器，
有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作
违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担
2）实验规范训练－量程的选择
天平
烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格
量程的选择－移液器
3）实验规范训练－标签
所用的器皿上一定要做标记
标签一定要贴到固定的位置
标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期
4）实验规范－实验操作
详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告
实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么
仔细操作和观察
保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉
3 实验准备
1） 清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等
2） 洗涤本学期实验用玻璃器皿
3） 配制试剂
4）高温灭菌
五、思考题
1.分子生物学实验常规仪器都有哪些？它们的适用范围是什么？
2.离心机在使用时应该注意什么？
3.除了常规仪器设备外，还有那些仪器设备可用于分子生物学实验？
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实验二 植物总DNA的制备与鉴定
Unit 2 Preparation and Identification of Plant Total DNA
一、实验目的
1.通过本实验了解从植物组织中提取DNA的原理与常用的方法。
2.掌握CTAB法提取植物基因组DNA的技术要点，加深对理论课学习的理解。
3.掌握DNA质量鉴定的常用方法，学会琼脂糖凝胶电泳的一般操作及电泳结果的观察与拍照技术。
4.通过本实验培养学生的基本操作技能与科学研究意识，激发学生学习的兴趣，训练学生的创新思维，培养学生严谨的科学作风。
二、实验原理
利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的CTAB （CetylTrimethylAmmonium Bromide，十六烷三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以有效的裂解细胞膜且与DNA 形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA 又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离，再经氯仿-异戊醇抽提去除蛋白，即可得到适合于酶切的DNA。PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，β-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。本法适用提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组DNA，但因提取步骤较多，从而会降低得率，不适于珍稀样本的基因组DNA 提取。
三、实验材料、仪器及用具
1. 仪器用品：冷冻离心机1台，电泳系统（4套）及凝胶成像仪（1台），移液器15套（0.1～10微升，2～20微升，10～100微升，100～1000微升，500～5000微升各一支）、1.5mL离心管1包枪头各1000μL、250μL、10μL各一包，陶瓷研钵（15套），不锈钢药匙及剪刀15把，一次性手套2包。
2.实验药品：液氮，三羟甲基氨基甲烷（Tris），乙二胺四乙酸（EDTA），氯化钠（NaCl），巯基乙醇，醋酸甲，异丙醇，无水乙醇，琼脂糖，花氰苷染料。
3.试剂
2*CTAB 提取液[2%CTAB 100mmol/L Tris-Hcl pH=8 20mmol/L EDTA pH=8
1.4mol/LNaCl 2%β-巯基乙醇 ] β-巯基乙醇 1*CTAB沉淀液[50mmol/LTris-HCl pH=8 10mmol/L EDTA pH=8 1%CTAB] TE 溶 液 缓 冲 液[10mmol/LTris-HCl pH=8 1mmol/L EDTA pH=8] 氯仿-异戊醇 24：1 75%乙醇 3mol/LNaCl 1%PVP
4.实验材料：植物新鲜叶片。
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四、实验方法与步骤
1.DNA粗提
（1）取样品0.5克于研钵中，加适量的液氮研磨成极细粉。
（2）将磨细的样品转入1.5ml的离心管中，加入500μl经预热至65℃的2×CTAB提取液（0.1mol/LTris-Hcl <PH8.0>,1.4mol/LNacl, 0.02mol/LEDTA,2%SDS）、10μl的2%β-巯基乙醇，50μl的2%PVP混匀，放入65℃水浴保温60min（每隔10min清摇一次），取出后冷却至室温。
（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒呈乳浊状，24℃下10000r/min离心15min。
（4）取上清液至另一干净的离心管中，加入异丙醇，上下颠倒几次后置于-20℃1h以上。
（5）取出于4℃下10000r/min离心15min，收集沉淀。
（6）沉淀用75%酒精清洗两次，分别于4℃下10000r/min离心5min。
（7）清洗后的沉淀放超净工作台风干至无味。
（8）加TE（10mmol/L Tris-Hcl <PH8.0>，1mmol/LEDTA<PH8.0>,高压灭菌）100μl溶解，于-20℃下保存。
2. DNA浓度及纯度鉴定
（1）紫外分光光度法检测
取所提DNA 50μl稀释60倍，以TE缓冲液做空白对照，测定260nm和280nm处的OD值，根据OD260/OD280比值，计算所得DNA的纯度，根据OD260值计算其浓度。根据1 OD260相当于50μg/mL的双链DNA，计算提取的DNA浓度。
计算公式如下：
DNA浓度（μg/μL）= OD260×α（稀释倍数）×50μg/mL÷1000
（2）琼脂糖凝胶电泳检测
取所提DNA5μL，与溴酚蓝上样缓冲液混匀后，上样于0.8%的琼脂糖凝胶，在90V电压下电泳1h。电泳结束后用凝胶成像系统观察DNA条带，并拍照。详细操作步骤见实验指导书第7页。
五、实验结果处理
1.对所提取的DNA根据外观特征（颜色，状态等）判断其质量。
2.根据紫外检测结果，定量判断所提DNA的纯度并计算其浓度。
3.根据琼脂糖电泳图像，判断样品纯度。
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六、思考题
1．分析植物组织总DNA提取的关键在哪里？
2．在实验过程中有哪些步骤是针对植物组织的特点而采取的，从自己的实验结果来看，你所采取的方法是否成功，那些地方需要改进？
3．影响琼脂糖凝胶电泳的主要因素是什么，怎样才能使条带更清晰？
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实验三 植物总RNA的提取
Unit 3 Extraction of Plant Total RNA
一、实验目的
1.通过本实验了解从植物组织中提取RNA的原理与常用的方法。
2. 学习RNA提取过程中抑制RNA酶活性的方法。
3.掌握RNA质量鉴定的常用方法，注意区别RNA提取与DNA提取的差别。
4.通过本实验培养学生的基本操作技能与科学研究意识，激发学生学习的兴趣，训练学生的创新思维，培养学生严谨的科学作风。
二、实验原理
RNA是一类极易讲解的分子，要得到完整的RNA分子必须最大限度地拟制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的讲解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被讲解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
1.高速冷冻离心机
2.高压灭菌锅
3.琼脂糖凝胶电泳系统
4.其他分子生物学常用仪器（移液器等）
5.液氮
6.紫外分光光度计
（二）材料
1.新鲜植物叶片
2. RNase-Free 1.5 mL 离心管
3. RNase-Free 1 mL、200μl、10μl 移液器吸头
4.陶瓷研钵
5.剪刀，一次性手套，口罩
（三）试剂
2×CTAB 提取液[2%CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl pH=8.0，2% β-巯基乙醇（用时现加）]；氯仿-异戊醇 24：1；75%乙醇；RNase-Free H2O。 10
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四、实验方法与步骤
（一）总RNA提取
①1.5ml离心管中加600μl CTAB提取缓冲液，于65℃加热。
② 液氮研磨2~3克样品，加入步骤①离心管中，迅速涡旋30秒，65℃水浴10分钟，加入等体积氯仿/异戊醇，混匀。
③4℃，12000rpm，离心10分钟，上清转移另一离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提一次。
④ 吸取水相，加1/3体积8M LiCl 使终浓度为2M，4℃，过夜，（或-20℃静置2小时）。
⑤ 4℃，12000rpm，离心20分钟，弃上清。沉淀先用500ul 70%乙醇洗2次，再用500ul无水乙醇洗1次。
⑥沉淀干燥后加20μl DEPC水溶解。取适量电泳检测。
如果使用提取试剂盒，具体步骤见说明书。
注意：实验过程中要勤换手套，尽量避免手上和唾液中RNase的污染。
（二）琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1.配置1%琼脂糖胶
2.120V恒压电泳15min。
3.凝胶成像系统下观察结果并拍照。
（三）紫外分光光度计测定浓度与纯度
方法同实验二DNA检测。
五、实验结果处理
1．紫外灯下观察可见18S rRNA和28S rRNA两条带，走在前面的为18S rRNA。
六、实验注意事项
1．本实验对实验器皿要求非常严格。RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除细胞内源RNA酶外，外界环境中灰尘、器皿、试剂、汗液、唾液中均存在RNA酶。各种器皿试剂都很容易被污染。这类酶耐热、耐碱、耐酸，煮沸15min也不能使之完全失活。操作时应戴手套。
2. RNA操作中的器皿应该用DEPC处理，操作如下：将器皿浸泡于0.1%DEPC溶液中12h，121高压灭菌15min，再70～80℃烘干。
七、思考题
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1．提取 DNA、RNA之前为什么要先进行高压灭菌？
2．提取 DNA、RNA的步骤主要有哪些？需要注意哪些问题
3．如何检测、评价提取的 DNA、RNA的质量？
4．如何确定提取的 DNA、RNA的浓度？
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实验四 聚合酶链式反应扩增目的DNA片段
Unit 4 PCR amplyfication of DNA Fragment
一、实验目的
1.了解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性及应用范围。
2.熟悉PCR基因扩增的基本原理。
3.掌握PCR基因扩增技术的具体操作过程。
二、实验原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction）简称PCR，它是Mullis于19xx年发明的一种体外快速扩增DNA序列的新技术。19xx年Saiki用耐热的TaqDNA聚合酶取代Klenow酶，使每次加热后无需添加酶，PCR技术趋于成熟。过去人们为了得到某一特定DNA序列，按传统的方法需将目的基因插入到载体DNA中，再将此重组载体导入宿主细胞内，经筛选和鉴定等操作获得分子克隆。而PCR技术只需数小时，就可将该特定基因扩增数百万倍，乃至数千万倍，从而免除了基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于PCR技术操作简单、实用性强、灵敏度高、自动化程度高，因而在分子生物学、基因工程研究、以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等的基因诊断和研究中获得了广泛应用。
PCR是在模板DNA、寡核苷酸引物、4种dNTP底物和TaqDNA聚合酶存在下进行的酶促反应，RNA引物与模板相结合并沿模板延伸，以合成靶序列DNA。PCR由3种基本反应组成：（1）变性：将模板DNA加热至90～95℃，使其解离成单链。（2）退火：使温度下降到35～70℃（一般低于模板Tm值的5℃左右 ），RNA引物即与模板DNA扩增序列的两侧按碱基配对原则相结合。（3）延伸：在适宜条件下（72℃），以RNA为引物，在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。经过“变性-退火-延伸”三个阶段构成一个PCR循环，每个循环的产物又可作为下一个循环的模板，因此经过几小时之后(约30个循环左右)，目的基因序列的拷贝数将增加106～107倍。
影响PCR反应的因素很多，主要包括PCR引物、反应温度和时间、Taq DNA聚合酶浓度、镁离子浓度以及PCR反应的循环次数等。
（1）引物：引物设计在PCR中占有十分关键的地位，好的引物在结构和组成上应满足以下条件：①引物长度应大于16bp(一般为18～25bp)，4种碱基分布比较均匀。②引物不应有发夹结构，即不含有4个碱基对以上的回文序列。②两引物之间不应有大于4个碱基对以上的互补序列，在3＇端不应有2个以上碱基互补。④两引物之间不应有 13
三明学院 分子生物学实验 预习指导 大于4个碱基对的同源序列。⑥引物与靶序列的Tm值不能过低，一般不低于55℃(按两引物中较低的Tm值计算)。（2）反应温度和时间：每PCR循环都要经历变性-退火-延伸三个阶段，各阶段所需温度和时间各不相同，名根据引物长度、靶序列DNA的Tm等因素确定PCR各阶段具体所需温度和时间。（3）在100μL反应体系中，Taq DNA聚合酶用量为1～2.5单位。酶量偏少PCR产物相应减少，酶量过高则会增加非特异产物。（4）PCR反应体系中镁离子浓度对引物与模板的结合、产物特异性、错误率、引物二聚体的生成以及酶的活性等方面都有较大的影响。一般控制在0.5～2.5mmo1/L之间。（5）由于dNTP溶液具有较强的酸性，配制时可用1mol/L氢氧化钠溶液将其pH值调至7.0～
7.5，分装于小管，置—20℃存放，过多的冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTP浓度为200μmol/L左右。（6）PCR反应循环次数一般以25～35循环为宜。这时待扩增DNA片段的数量可达到或接近最高值。循环次数太少，PCR产物数量相应减少，而当反应超过35个循环，PCR产物也不再增加。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
1.PCR仪、台式离心机
2.灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统
3.紫外灯检测仪
4.微量移液器（10～1000?l，20～200?l，0.5～10?l，0.1～2.5?l）
（二）材料
0.2mL PCR管，1.5mL 离心管，1000?l，250?l，10?l移液器吸头。
（三）试剂。
1.TaKaRa Taq (5U/ ml)
2.10×PCR缓冲液(Mg2+ Plus)
3.dNTP混合液(each 10mM)
4.DNA模板 (10ng)
5.引物（引物1和引物2各10 mM）
6.PCR 混合液:
（1）模板 DNA: 1 ?l (10ng)
（2）引物1: 1 ?l (10mM)
（3）引物2: 1 ?l (10mM)
（4）dNTPs: 1 ?l (10mM)
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（5）Taq DNA聚合酶: 0.5 ?l(5U/?l)
（6）10×缓冲液: 5 ?l
（7）重蒸水: 40.5?l
7.100bp DNA Marker
四、实验方法与步骤
1.在一个无菌的0.5mL Eppendorf离心管内加入PCR混合液50 ?l混匀，用100?l矿物油覆盖于反应混合液之上，以防止反应过程水分蒸发。
2.将Eppendorf离心管放入PCR仪反应仓中。
3.设置PCR反应条件为：
94℃变性5min后开始以下循环
94℃变性反应45 sec；65℃退火反应45 sec；72℃延伸反应1 min；进行30个循环；最后72℃反应7min；4 ℃冷却恒定。
4.PCR产物分析：
采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性，根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量，电泳方法见实验一质粒DNA的琼脂糖电泳。
五、实验结果处理
1．根据凝胶电泳图像中条带的清晰、明亮程度来判断扩增效果。
2．根据电泳胶片上DNA Marker 来判断扩增到的片段是否为目的片段。
六、实验注意事项
1.用PCR扩增目的基因，一般多采用商品试剂盒。若自己配制试剂，配好后必需高压灭菌。
2.引物决定PCR扩增的特异性，一定要根据目的基因的核苷酸序列仔细设计好3＇端和5＇端引物。
3.用于PCR扩增的模板DNA一定要纯，以防止反应体系被痕量非目的基因模板污染。
4.吸加PCR试剂时戴上新塑料手套，并在超净工作台上操作，避免操作不当建成污染。
七、思考题
1.一个好的引物在结构和组成上应满足以下条件？
2.谈谈你所知道的有关PCR技术的应用范围？
3.影响PCR反应的因素有哪些？它们对目的基因扩增有何影响？
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4.采用PCR技术扩增目的基因的原理是什么？
5.为么什要求纯度很高的DNA才能做为PCR的模板？
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实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
Unit 5 Recovering DNA Band from Agarose Gel
一、实验目的
学习与掌握从琼脂糖电泳中回收DNA片段的方法。
二、实验原理
对于混合的DNA样品（例如限制性酶切产物等）进行检测和纯化的一种常用方法是进行琼脂糖电泳分析，从电泳后的凝胶中回收出某一DNA带，经过有机溶剂的抽提等一系列纯化过程，便可得到纯化的DNA片段，回收的方法很多，如：电泳洗脱法、冻融挤压法、扩散浸出法、低熔点胶熔化法等，各种方法各有其优点，根据所要回收的DNA分子大小，回收的规模，凝胶的浓度等具体情况选择一种回收方法。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
1.PCR仪、台式离心机
2.紫外灯检测仪
3.恒温水浴锅
4.微量移液器（10～1000?l，20～200?l，0.5～10?l，0.1～2.5?l）
（二）材料
1.实验四的PCR产物或者λDNA的EcoR Ⅰ酶切产物
2.0.2mL PCR管（高压灭菌，无Dnase污染）
3.1.5mL 离心管（高压灭菌，无Dnase污染）
4.1000?l，250?l，10?l移液器吸头（高压灭菌，无Dnase污染）
（三）试剂
从公司购买DNA回收试剂盒
四、实验方法与步骤
方法参照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。
五、实验结果处理
回收得到的DNA取少量电泳或紫外检测，判断回收的片段是否正确及其纯度。
六、思考题
如何提高凝胶中DNA片段的回收效率？
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实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备
Unit 6 Preparing competent cells of E.coli
一、实验目的
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法。
二、实验原理
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
1. 超净工作台。
2. 恒温水浴锅。
3. 恒温摇床、培养箱。
（二）材料
E. coli DH5α菌(R-，M-，Amp-)。
（三）试剂
1.LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。
2.LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
3.0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2(无水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。
四、实验方法与步骤
1.菌体的培养
（1）受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
（2）再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至OD600为0.5左右。
2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
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（1）将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min。
（2）弃去上清，用预冷的 0.05 mol/L 的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置 15-30 min 后，4℃ 下 3000g 离心10 min。
（3）弃去上清，加入 4mL预冷含15%甘油的 0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。
（4）感受态细胞分装成 200μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。
以上操作均须无菌环境，在超净工作台上进行。
技术路线图
从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37℃
振荡培养过夜。
↓
以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中
↓
37℃振荡培养2～3h
↓
将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min
↓
4000rpm，离心10min回收细胞
↓
倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽
↓
用冰冷的0.1mol/L CaCl 21mL，悬浮沉淀
↓
立即放在冰上保温30min
↓
4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞
↓
用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 0.1mL悬浮细胞（务必放冰上）
↓
分装细胞，每100μl一份。此细胞为感受态细胞。
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五、实验结果处理
制备好的感受态细胞，每100μl一份分装，贮存于-70℃，供下次实验“质粒载体与外源DNA片段的连接与转化”用。
六、实验注意事项
1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
2.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
3.实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
七、思考题
1．感受态细胞制备的原理是什么？
2．在制备感受态细胞的实验中要注意哪些细节？
3．影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？
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实验七 DNA重组
Unit 7 Construction and Transformation of the Recombinant DNA
一、实验目的
通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。
二、实验原理
（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源DNA和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。
此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。
（二）ＤＮＡ的转化
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体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
1. 超净工作台
2. 恒温水浴锅
3. 恒温摇床
4. 恒温培养箱
5. 低温离心机
（二）材料
1.外源DNA片段：实验五回收的DNA片段溶液，浓度已知。
2.载体DNA：pUC19质粒
3.宿主菌：E. coli DH5α
4.EcRΙ酶
5.T4 DNA 连接酶
6.λDNA
（三）试剂。
1.1.0×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer
200mM Tris-HCl(pH7.6)
50mM MgCl2
50mM 二硫苄糖醇
500μg/ml BSA
2. ＬＢ培养基
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3. CaCl2 0.1M
4. Amp
四、实验方法与步骤
（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应
1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴５分钟使重新退火的粘端解链， 迅速将混合物转入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl。
2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
3、１２℃下过夜连接反应。
4、反应结束后于－２０℃保存。
5、再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体DNA连接酶的活性。
（二）ＤＮＡ的转化
1.感受态细胞制备（见实验5）
2.转化
（1）在１.５ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细胞和１０μl ＤＮＡ （４０ng）溶液， 温和混匀，于冰上３０分钟。
（2）于４２℃水浴９０秒。
（3）冰浴２分钟。
（4）加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
（5）取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿，３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
质粒pUC19的转化技术路线
在100μl新鲜配制的感受态细胞中加入pUC19 DNA2μl(≤50ng)，混匀同时做以下对照管
受体菌对照：100μl感受态细菌+2μl无菌水
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质粒对照：100μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl质粒
↓
冰上放置30min
↓
将管放到42℃循环水浴热冲击90s
↓
取出，迅速冰浴2min
↓
每管加400μl LB液体培养基，37℃慢摇复苏1h
↓
取50μl已转化的感受态细胞或对照样品，
各分别涂在含有或不含有氨苄青霉素的培养皿中
↓
待吸干菌液后，倒置培养皿，于37℃培养过夜
↓
次日观察，并记录转化情况，计算转化率（转化子数/μgDNA）。
五、实验结果处理
1．电泳检查连接结果。
2．计算转化率。
3．根据转化率和阴性对照分析实验结果。
六、实验注意事项
1．连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
2．DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3．碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4．连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
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5．如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。
6. -80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。
7. 用无ＤＮＡ转化物的感受态细菌铺板，若有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够或有杂菌污染。。
七、思考题
1. 简述T4DNA连接酶作用机理。
2. 简述一个完整外源DNA的克隆过程。
3. 连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率？
4. 根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？
5. 抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
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实验八 质粒DNA的提取
Unit 8 Isolation of the plasmid DNA
一、实验目的
掌握质粒DNA提取的方法。
二、实验原理
本鉴定方法是用碱性裂解液把转化子菌体裂解。
三、实验材料、仪器及用具
（一）仪器
同实验二
（二）材料
实验六得到的克隆。
（三）试剂
1.含抗生素LB平板
2.10 mM EDTA（pH8.0）
3.1 M KCl
4.10×载样缓冲液
5. 0.8%琼脂糖凝胶
6.2×碱性裂解液:
母液
4 M NaOH
10%SDS
蔗糖
四、实验方法与步骤
1. 用牙签从转化选择平板选取几十个白色和几个蓝色菌落，殖在LB平板上，37 ℃过夜。
2. 在96孔平板每孔加入20 ?l 10 mM EDTA。
3. 用牙签挑取少量菌体（不能太多），悬浮于各孔中（其中1-2孔是蓝色菌落作为对照），将平板接触旋涡器几秒钟。
4. 加入20 ?l裂解液，将平板接触旋涡器几秒钟，静置5 min。
26 配制50 ml所需的量 最终浓度 2.5 ml 2.5 ml 15 g 0.2 M 0.5% 30%
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5. 将等量的1 M KCl和载样缓冲液混合，各孔中加入6 ?l，将平板接触旋涡器几秒钟
6. 按蓝色菌落，白色菌落??最后蓝色菌落的顺序，各取20-30 ?l点样。
7. 电泳，观察。与蓝色菌落质粒迁移率比较，可判别白色菌落的重组质粒是否含有插入子。
五、实验结果处理
1．绘制电泳图。
2．统计重组克隆的比例。
六、实验注意事项
1．挑取菌落勿太少，也不能太多。
2．裂解后菌液较粘，点样时吸管头勿垂直出以免带出点样孔内的菌液样品。
七、思考题
1．简述蓝白筛选的工作原理？
2．简述琼脂糖凝胶鉴定重组子的实验原理。
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