第三篇室内检验员专业技术知识
第九章 种子检验总则
第一节 种子检验概论
一、种子检验的含义
种子检验(seed testing)---是指按照规定的种子检验程序，确定给定农作物种子的一个或多个质量特性进行处理或提供服务所组成的技术操作，并与规定要求进行比较的活动。
1.在实践中，我国目前采用国际种子检验协会(ISTA)的习惯称谓，将上述含义中的种子检验程序（testing procedure）或者种子检验方法（testing method）称为检验规程（testing rules），如国家发布的GB/T 3543《农作物种子检验规程》。
2.质量特性俗称质量指标，由特性（如发芽率、水分）和特性值组成。
可将种子质量特性分为四大类：
一是物理质量，采用净度、其他植物种子计数、水分、重量等项目的检测结果来衡量；
二是生理质量，采用发芽率、生活力和活力等项目的检测结果来衡量；
三是遗传质量，采用品种真实性、品种纯度、特定特性检测（ISTA 20##年命名的新术语，代替过去所称的转基因种子检测。由于该术语比较准确描述了测定的内涵，受到各国的好评）等项目的检测结果来衡量；
四是卫生质量，采用种子健康等项目的检测结果来衡量。
我国开展最普遍的主要还是净度、水分、发芽率和品种纯度等特性。
二、种子检验的目的和作用
1.种子检验是通过对品种的真实性和纯度、净度、发芽率、生活力、活力、种子健康、水分和千粒重等项目进行检验和测定，评定种子的种用价值，以指导农业生产、商品交换和经济贸易活动。
2.目的就是选用高质量的种子播种，杜绝或减少因种子质量所造成的缺苗减产的危险，减少盲目性和冒险性，控制有害杂草的蔓延和危害，充分发挥栽培品种的丰产特性，确保农业生产安全。
3.种子检验的作用主要体现在以下几个方面：
※1．把关作用。检验员通过对种子质量进行检验、测定、鉴定，最终实现两重把关：一是把好商品种子出库的质量关，可以防止不合格种子流向市场；二是把好种子质量监督关，可以避免不符合要求的种子用于播种生产。
※2．预防作用。从过程控制而言，对上一过程的严格检验，就是对下一过程的预防。通过对种子生产过程中原材料（如亲本）的过程控制、购入种子的复检以及种子贮藏、运输过程中的检测等，可以防止不合格种子进入下一过程。
※3．监督作用。种子检验是种子质量宏观控制的主要形式，通过对种子的监督抽查、质量评价等形式实现行政监督的目的，监督种子生产、流通领域的种子质量状况，以便达到及时打击假劣种子的生产经营行为，把假劣种子给农业生产带来的损失降到最低程度。
※4．报告作用。种子检验报告是国内外种子贸易必备的文件，可以促进国内外种子贸易的发展。
※5．调解种子纠纷的重要依据。监督检验机构出具的种子检验报告可以作为种子贸易活动中判定质量优劣的依据，对及时调解种子纠纷有重要作用。
※6．其他作用。如可以提供信息反馈和辅助决策作用等。
三、种子检验发展简史
（一）国际种子检验发展概况
※为了维护种子贸易的正常开展，种子检验应运而生。1869年5月1日，德国诺培（Friedrich Nobbe）教授首先在萨克森州塔朗特(Tharandt)小镇上建立了世界上第一个种子检验站，并开展了种子真实性、净度和发芽率等种子质量特性检验工作，从而宣告了种子检验的正式诞生。他总结前人工作经验和自己的研究成果，于1876年编写出版了《种子学手册》。因此，诺培教授成为国际公认的种子检验和种子科学的创始人。
※1897年美国颁布了标准种子检验规程。
※1906年在德国举行了第一次国际种子检验大会。
※1908年美国和加拿大两国成立了北美官方种子检验员协会(简写AOSA)。
※1921年欧洲种子检验工作者在法国举行了大会，成立了欧洲种子检验协会(简写ESTA)。
※1924年在英国剑桥召开了第四次国际种子检验大会，大会决定把种子检验活动延伸至全世界，将欧洲种子检验组织改为现在的国际种子检验协会(International Seed Testing Association，简称ISTA
※ISTA制定的《国际种子检验规程》被全世界各国广泛承认和采纳。ISTA已成为全球公认的有关种子检验的权威标准化组织，
※截止20##年6月，已发展成为由156个会员检验站（其中96个为ISTA认可检验站）、205名会员代表组成，代表72个国家的大范围协作网。
※ISTA成立82年来，已先后召开了27届大会，制订并多次修订了国际种子检验规程（目前已出版了2006版国际种子检验规程），编写出版了有关种子刊物和有关手册，如幼苗鉴定手册等，对世界种子科学技术的发展特别是种子检验作出了卓越的
（二）我国种子检验概况
四、种子检验的内容和程序
（一）种子检验内容
※分为扦样、检测和结果报告三部分。
※扦样是种子检验的第一步，从种子批中随机抽取一小部分相当数量的有代表性的供检验用的样品。
※检测就是从具有代表性的供检样品中分取试样，按照规定的程序对包括水分、净度、发芽率、品种纯度等种子质量特性进行测定。
※结果报告是将已检测质量特性的测定结果汇总、填报和签发。
（二）种子检验程序
※种子检验必须按步骤根据种子检验规定的程序图进行操作，不能随意改变。种子检验程序可详见图9-1。
五、检验方法确认
※种子检验的宗旨是要确保种子检验结果的一致性，由于检验方法对检验结果影响较大，历来属于必控的主要要素之一。
※随着检验技术和方法的快速发展，对检验方法的控制和管理就显得越来越重要。
※如何确认检验方法，必须制定统一的规范。国际种子检验协会从20##年开始先在种子健康检验方法采用方法确认的方式，随后应用于种子活力检验方法，并已决定将方法确认适用于所有的种子检验方法，而且在提出国际规程的修订提议中必须先通过方法确认。
方法确认依据分为四类：
※一是新种类检测方法的研发，即没有现行的检测方法或虽有通用方法却没有很好确定或描述；
※二是比较不同方法，以选择一种公认的检验方法；
※三是检测方法的维持，即已经有明确规定的方法，由于新技术的发展，这些方法的要素是否要进行改良以提高水平；
※四是试验方法与新方法比较。
※方法确认的途径主要有多个试验室确认方法、特性确认方法等。
※确认过程通常包括：
※ 方法选择和研发；
※ 通过比对试验进行确认；
※ 比较试验结果评审；
※ 技术委员会的方法认可和方法准备；
※ 技术委员会的最后接受并将其列于标准出版。
六、检测工作质量控制
※种子检验工作就是通过检测手段对种子质量状况给出准确的评价和判定，检测工作质量控制则是种子检验结果准确、公正、客观的关键措施。
（一）建立有效的质量控制程序
※种子质量检验机构必须有对所进行的检验的有效性进行监控的程序，包括样品管理程序、检验过程监控程序、不符合检测和扦样工作控制程序等。
（二）实施严格的过程管理
※1．检验前管理
检验开始前，要做好一切的准备工作，主要包括：
※检验机构制定方案，落实任务；
※依据规程规定的程序和任务要求扦取种子样品，检验机构按照规定制备试验样品，分送有关检验室；
※所有的使用仪器，必须在有效的检定周期内，均处于受控状态，保证量值准确，能溯源到国家基准，仪器使用前要对仪器状态进行查看，并做好记录；
※检验室对温度、湿度、生物细菌、电源、供水和排水进行有效的控制，并做好记录。
※2．检验过程管理
在检验过程中，检验员对所使用的规程进行检查：
※是否是当前批准有效版本；
※对送来的检验试样及有关手续核查是否与所检测项目相符合；
※依据检验规程规定，对所检验项目逐项检验；
※对所检验项目的结果及时按程序填写原始记录；
※检验项目结束，要及时将结果送有关人员编制检验报告，并依据规定分别审核和签发。
（三）不符合工作的管理
※所谓不符合检验和扦样工作的控制，实际上是指对检验和扦样工作不符合程序规定而导致检测结果发生差错的现象加以控制。
※对客户的投诉、质量保证人员的监督记录和报告、人员差错、仪器设备差错、方法上的问题、环境条件失控、校准或溯源上的失控、原始记录的差错、数据处理的差错、检验报告的差错、内部审核发现的差错、管理评审中发现的问题、外部审核中发现的问题、能力验证中发现的问题、质量控制中发现的问题，要及时分析原因，并加以解决。
※扦取代表性的样品来估测种子批的质量状况。这就涉及利用样本来推测总体的过程，即存在容许误差问题。
一、检验数据的差异
（一）种子检验中数据统计模式与假设
※在质量数据的统计分布中，种子检验规程主要涉及正态分布、二项分布和泊松分布。
（二)检验数据表示的含义
※对种子进行检测所得到的检测结果主要用于两个方面
※1．估测种子批的质量
※用于估测种子批质量一般采用置信区间表示，如某一种子批采用400粒试样进行发芽试验，平均结果为90％，其检测报告可以这样表述：“测定400粒种子，发芽率为90％，由于扦样差异，该批种子的发芽率在99％置信区间表明可能低至85％或高至93％”；
※又如在50g试验样品中发现6粒某一种类的杂草种子，其概率为95％的置信区间为2.20～13.06粒种子，检测报告可以这样表述：“在50g样品中发现6粒某一种类杂草，但是在种子批中，每50g平均数目可高达13粒”。
※一个最典型的例子是，在测定危害性杂草种子时，经常在样品检测结果时为零，这时绝不能推断种子批的结果为零，只能表述为在种子检验样品检测时未检测到该危害性杂草种子，否则，检测机构可能会遇到麻烦，容易被告上法庭。
※2．用于估测值判别或比较
※用来判别估测值是否与另一个估测值或规定值一致，通过二尾或一尾测定来判别检测后的估测值是否与规定值或另一个估测值相一致。
（三）检验数据差异的来源与控制
※种子检验数据差异来源主要来自下列五个方面：
※1．扦样所引起的差异
※如果种子批是均匀的，并且是按检验规程进行扦样的，那么这种扦样差异就是随机扦样差异。这种扦样的差异是由从种子批中扦取初次样品、送验样品制备以及试验样品制备过程中所引起的差异。
※2．种子批质量不同所引起的差异
※随着种子批质量的降低，随机扦样差异的机会增加，如发芽率为95％时，标准差是2.1，这时其差异范围是±6.5。
※3．检测样品大小所引起的差异
※随着种子样品增大，差异减少，结果也越可靠。样品从50粒增加到200粒，误差减少一半；从200粒增加至800粒，误差又减少一半。通常采用的发芽试验试样为400粒，是兼顾相对较低的误差和较低的费用。
※4.不同种子检验员以及不一致评价引起的差异。
※5.试验条件和试验方法引起的差异。
※前三者由扦样所引起的误差为第一类，后两者由条件所引起的为另一类。
※可以采取措施对误差加以控制，如严格控制试验条件；对检验方法和样品大小标准化；采用准确的扦样程序；通过培训造就高水平的种子检验员。
※即使这样，仍然存在着差异。这主要是由于随机扦样误差，检测中未考虑的一些未知因素，以及样品内的生物差异等。所以，检验员应该知道哪些差异是可以接受的，哪些试验或重复间的显著差异是不能接受的。
※系统误差可以控制，随机误差不能控制
※假如种子批是均匀一致(同质)的，而且按现行规程所规定的方法进行扦样和分样，那么前三者的差异主要是随机扦样差异，这种差异完全可以用数理统计模式进行估算，而后两者检验员和试验条件所引起的差异可以凭经验进行修正，国家标准规定的容许误差表已经包含了这些内容。
二、容许误差
（一）容许误差中关键术语的释义
（二）GB/T 3543.1—1995中规定的四种容许误差及其用法
※1.同一检验室同一送验样品重复间的容许误差
※GB/T 3543.1—1995中6.1条所规范的容许误差属于两尾测定，适用于同一检验室同一送验样品重复间的检验，检查其差异是否显著。这类情况非常简单也非常容易懂。
※三个重复时 ：发芽试验的四个重复为81、86、85和62，这样按照GB/T 3543.4进行计算，显然是超过容许误差。然而在试验期间发现第四个重复有误(如发芽床非常干)，在这种情况下，可以把第四个重复去掉。这样三个重复的平均值为84％，这时容许误差须查GB/T 3543.7—1995《农作物种子检验规程 其他项目检验》中的表2，查得其容许误差为13(查“3次重复”栏)，不难验证这三个重复是在容许范围内。
※2.从同一种子批扦取的同一或不同送验样品，经同一或另一检验机构检验，比较两次结果是否一致。
※GB/T 3543.1—1995中6.2条所规范的容许误差属于两尾测定，即比较两个估测值是否一致。这类情况在种子检验中也经常使用，特别是下列两种情况：
※一是适用于重新试验，如发芽试验第一次试验结果超过容许误差后，重做的第二次试验结果要与第一次试验结果进行试验一致性比较，如果是一致的，最后的填报结果为两者的平均值。
※二是适用于核对检查(check test)。在日常种子检测工作中，核对检查应用非常广泛，如为了保证检测结果准确性，一位检验员分析后，另一位检验员进行核查，这种核对检查是种子检验室内部质量控制的方式之一。
※核对检查广泛用于核对认可扦样员、认可检验员的资格和能力。认可的扦样员或检验员对一批种子扦样或检验后，官方扦样员或检验员对同一种子批进行扦样或检验，以核查认可的扦样员、检验员所掌握的扦样、检验技术能力和工作的独立性，这在全球种子质量认证中已得到广泛应用。
※3.从同一种子批中扦取的第二个送验样品，经同一或另一个检验机构检验，所得结果较第一次差
※GB/T 3543.1-1995中6.3条所规范的容许误差属于一尾测定，即先固定第一个估测值，再将第二个送验样品的估测值与第一个估测值进行比较。
※第一个估测值往往是卖者测定或在标签、发票、国际证书上所标明的值，第二个估测值是第二个送验样品的检测值，往往第一个估测值测定在第二个估测值之前。这类情况在对种子质量有争议、检测等级是否符合要求等方面经常使用，重新扦样、检测，确认是否存在着显著差异。
※4.抽检、统检、仲裁检验、定期检验等与种子质量标准、合同、标签等规定值比较
※GB/T 3543.1-1995中6.4条所规范的容许误差属于一尾测定。种子批的一个估测值出来后，与规定值进行比较，来验证是否符合标准的要求。看上去这种情况比较容易理解，但实际上涉及到两类错误问题。
※净度为例： GB/T 3543.3-1995中均为一尾测定，表3为1%显著水平 ，表5为 5%显著水平
第三节 检验报告
※种子检验报告是指按照GB/T 3543.1-3543.7进行扦样与检测而获得检验结果的一种证书表格。
一、签发检验报告的条件
※1．签发检验报告机构目前从事检测工作并且是考核合格的机构
※签发检验报告的机构必须有专门从事种子检验的人员和检验场所，目前从事种子检测工作，并且通过能力考核合格的种子检验机构。
※2．被检种属于规程所列举的一个种
※这一条规定了检测能力的产品范围。明确规定如要出具农作物种子检验报告，其种子只能属于 GB/T 3543．2—1995表1中所列举的124个种类中的一种，不能签发未列入规程的种或规程中列入种的混合种的检验报告。
※3．检验按规定的方法进行
※检验必须采用规程规定的方法。
※4．种子批与规程规定的要求相符合
※种子批的每个容器必须封口，并有批号。只有这样，检验报告才与种子批联系起来，实现可追溯性。
※5.送验样品是按规程要求扦取和处理的
※报告上的检测项目所报告的结果只能从同一种子批同一送验样品所获取，供水分测定的样品需要防湿包装。
※上述第4和第5条的规定只适用于签发种子批的检验报告，对于一般委托检验只对样品负责的检验报告，没有必要要求符合第4和第5条的规定。
二、检验报告内容和要求
※1．检验报告内容
※检验报告的内容通常包括如下内容：
※(1)标题；
※(2)检验机构的名称和地址；
※(3)用户名称和地址；
※(4)扦样及封缄单位的名称；
※(5)报告的惟一识别编号；
※(6)种子批号及封缄；
※(7)来样数量、代表数量(即批重)；
※(8)扦样时期；
※(9)接收样品时期；
※(10)样品编号；
※(11)检验时期；
※(12)检验项目和结果；
※(13)有关检验方法的说明；
※(14)对检验结论的说明；
※(15)签发人
※2．检验报告要求
※(1)报告内容中的文字和数据填报，最好采用电脑打印而不用手写；
※(2)报告不能有添加、修改、替换或涂改的迹象；
※(3)在同一时间内，有效报告只能是一份(请不要混淆：检验报告一式两份，一份给予委托方，另一份与原始记录一同存档)；
※(4)报告要为用户保密，并作为档案保存六年；
※(5)检验报告的印刷质量要好。
※检测结果要按照规程规定的计算、表示和报告要求进行填报，如果某一项目未检验，填写“—N—”表示“未检验”(not tested)。
※未列入规程的补充分析结果，只有在按规程规定方法测定后才可列入，并在相应栏中注明。
※若在检验结束前急需了解某一测定项目的结果，可签发临时结果报告，即在结果报告上附有“最后结果报告将在检验结束时签发”的说明。
三、检验报告的填写
（一）表头信息的填写
※1．签发检验报告的单位名称和地址应采用全称。
※2．日期填写格式按照CCYY—MM—DD，如：1997—07—2l。
※3．检验报告上应用印章注明“正本”或“副本”。
※4．种的学名与GB/T 3543.2—1995中的表l一致，不能确定种名的，可用属名。
（二）检测内容的填写
1．净度分析
※①净种子、杂质和其他植物种子的重量百分率保留一位小数，三种成分之和为100．0％。
※②成分小于0．05％的，填报“TR”(微量)。
※③杂质和其他植物种子栏的检测结果必须填报，如果检测结果为零，填报“—0.0—”或“NIL”。
※④其他植物种子的学名以及杂质种类必须在报告上填报。
※⑤如果某一杂质种类、其他植物种类或复粒种子单位(MSU)的含量超过1％或更多，必须在报告上填报。同样，如果应用户要求，超过0.1％的须填报，也应在报告上注明。
※⑥其他植物种子也可按其他作物种子和杂草种子分列。
※其他植物种子数目检测结果内容填写要求为：
※①除检测种以外，应报告在规定重量中所发现的所有每一种类的数目。
※②标明检测方法：完全检验、有限检验、简化检验。
※③结果用每kg(千克)的种子数或单位重量的种子数表示。
※④种名采用学名。
2．发芽试验
※①发芽试验以最近似的整数填报，并按正常幼苗、硬实、新鲜不发芽种子、不正常幼苗和死种子分类填报。
※②正常幼苗、硬实、新鲜不发芽种子、不正常幼苗和死种子以百分率表示，总和为100％。如果某一栏为零，该栏必须填报为“—0—”。
※③如果发芽试验时间超过规定的时间，在规定栏中填报末次计数的发芽率。超过规定时间以后的正常幼苗数应填报在附加说明中，并采用下列格式：“到规定时间X天后，有Y％为正常幼苗。”
※④表格中的附加说明一般包括：发芽床、温度、试验持续时间、发芽试验前处理和方法。发芽试验采用的方法用规程中的缩写符号注明，如采用纸间在20℃下进行试验，就用BP，20℃表示。
3．水分
※水分测定项目应填报至最接近的0.1％。
4．生活力四唑测定
※生活力四唑测定应按下列格式填报：“四唑测定： ％有生活力种子”(有硬实也需填报)。
5. 重量测定
※重量测定应按下列格式填报：“重量(千粒)： g”。
6. 种子健康测定
※种子健康测定应填报病原菌的学名，以及感染的百分率。同时填报测定方法的信息。如对菜豆样品健康的测定：Ascochyta Fabae：X％种子感染。
7. 品种纯度鉴定
※品种纯度鉴定应填报品种纯度百分率，以及附加信息如检测方法、检测样品数等内容。
8．包衣种子
※包衣种子，需在种名后注明哪一种类的包衣种子，如填“玉米，包膜种子”。净包衣种子、杂质和未包衣种子的百分率必须分别在“净种子”、“杂质”和“其他植物种子”栏中填报。
（三）其他可填报的内容
※种子贸易有时往往要求报告注明有关与种子质量真实性说明(如标准、标签、合同等)符合性情况。规程规定的报告也允许在检验报告中注明这些符合性说明(但不是报告的必需内容)，这种符合性说明在很多场合下称为检验结论。
※若扦样是另一个检验机构或个人进行的，应在结果报告上注明只对送验样品负责。
（四）有关检测数据的数字修约
1．种子检验规程的规定
① 称重方面
※所有样品称重(包括净度分析、水分测定、重量测定等)时，应符合GB/T 3543．3—1995表1的要求，即1g以下保留四位小数，1～10g保留三位小数，10～100g保留二位小数，100～1 000g保留一位小数。
② 计算保留位数
※净度分析用试样分析时，所有成分的重量百分率应计算到一位小数；用半试样分析，各成分计算保留两位小数。
※在多容器种子批异质性测定中，净度与发芽的平均值X根据N而定，如N小于10，则保留两位小数，如N大于或等于10，则保留三位；指定种子数的平均值根据N而定，如N小于10，则保留一位小数，如N大于或等于10，则保留两位小数。
※在水分测定时，每一重复用公式计算时保留一位小数。
③ 修约
※在净度分析中，最后结果的各成分之和应为100．0％，小于0．05％的微量成分在计算中应除外。如果其和是99．9％或100．1％，从最大值(通常是净种子成分)增减0．1％。
※在发芽试验中，正常幼苗百分率修约至最接近的整数，0.5则进位。计算其余成分百分率的整数，并获得其总和。如果总和为100，修约程序到此结束。
※如果总和不是100，继续执行下列程序：
※ 在不正常幼苗、硬实、新鲜不发芽种子和死种子中，首先找出其百分率中小数部分最大值者，修约此数至最大整数，并作为最终结果；
※ 其次计算其余成分百分率的整数，获得其总和，如果总和为100，修约程序到此结束，如果不是100，重复此程序；如果小数部分相同，优先次序为不正常幼苗、硬实、新鲜不发芽种子和死种子。
④ 最后保留位数
※净度分析保留一位小数，
※发芽试验保留整数，
※水分测定保留一位小数，
※品种纯度鉴定保留一位，
※生活力测定保留整数，
※重量测定保留 GB/T 3543．3—1995表1所规定的位数等。
2．其他方面的规定
※（1）几个数字相加的和或相减的差，小数后保留位数与各数中小数位数最少者相同；
※（2）几个数字相乘的积或相除的商，小数后保留位数与各数中小数位数最少者相同；
※（3）进行开方、平方、立方运算时，计算结果的有效数字位数与原数字相同；
※（4）某些常数、倍数或分数的有效数字位数是无限的，根据需要取其有效数字的位数。
第十章 净度分析
第一节 概述
一、净度分析的目的和意义
（一）目的
※种子净度即种子清洁干净的程度，是指种子批或样品中净种子、杂质和其他植物种子组分的比例及特性。
※净度分析（purity analysis）的目的是通过对样品中净种子、其他植物种子和杂质三种成分的分析，了解种子批中洁净可利用种子的真实重量及其他植物种子及无生命杂质的种类和含量，为评价种子质量提供依据。
（二）意义
二、净度分析与其他植物种子数目测定内容
净度分析内容：
※一是测定供检样品各成分的重量百分率，并据此推测种子批的组成。种子分为净种子、其他植物种子和杂质三种成分，
※二是鉴别样品中其他植物种子和杂质所属的种类。
※若是杂草种子则是有害的。这条规定了样品中所有种必须一一鉴定出来，其学名应采纳国际种子检验协会(1987)编的《国际种子检验协会植物固定学名索引》，这就要求检验员应有广泛的植物形态和分类学知识。
※其他植物种子数目测定是测定样品中其他植物种子的数目或找出指定的其他植物种子。
※在净度分析中，已列出其他植物种子的重量百分率和种类，为什么还要测定其他植物种子数目？
※这是因为净度分析的重量百分率表示存在着两方面的缺陷，一是重量百分率最多只能表达0.1%, 相当于小麦种子中混有2～3粒以上的种子，若只有1～2粒种子却不能表示出来；二是杂草种子大小差异很大，如杂草种子重量百分率为1％，对于田野毛茛将含800粒种子，对于卷耳(Cerastium vulgatum)含有100,000粒种子。因此，为了弥补这一缺陷，引入了以其他植物种子数目测定这一检测项目。
※在国际种子贸易中，主要是用于测定种子批中是否含有有毒或有害的种子。
第二节 净度分析组分的划分规则
一、组分划分规则
（一）净种子
※下列构造凡能明确地鉴别出它们是属于所分析的种（已变成菌核、黑穗病孢子团或者线虫瘿除外），即使是未成熟的、瘦小的、皱缩的、带病的或发过芽的种子单位都应作为净种子。
※1．完整的种子单位。种子单位（seed unit）即通常所见的传播单位，包括真种子瘦果、类似的果实、分果和小花。在禾本科中，种子单位如是小花须带有一个明显含有胚乳的颖果或裸粒颖果（缺乏内外稃）。
※2．大于原来大小一半的破损种子单位。
※根据上述原则，在个别的属或种中有一些例外：
※（1）豆科、十字花科，其种皮完全脱落的种子单位应列为杂质。
※（2）即使有胚芽和胚根的胚中轴，并超过原来大小一半的附属种皮，豆科种子单位的分离子叶也列为杂质。
※（3）甜菜属复胚种子超过一定大小的种子单位列为净种子，但单胚品种除外。
※（4）在燕麦属、高粱属中，附着的不育小花不须除去而列为净种子。
（二）其他植物种子
※其他植物种子（other seeds）是指净种子以外的任何植物种类的种子单位（包括其他植物种子和杂草种子）。其鉴别标准与净种子的标准基本相同。但甜菜属种子单位作为其他植物种子时不必筛选，可用遗传单胚的净种子定义。
（三）杂质
※杂质（inert matter）除净种子和其他植物种子以外的所有种子单位、其它物质及构造。
※1．明显不含真种子的种子单位。
※2．甜菜属复胚种子单位大小未达到净种子定义规定的最低大小的。
※3．破裂或受损伤种子单位的碎片为原来大小的一半或不及一半的。
※4．按净种子的定义，不将这些附属物作为净种子部分或定义中尚未提及的附属物。
※5．种皮完全脱落的豆科、十字花科的种子。
※6．脆而易碎、呈灰白色、乳白色的菟丝子种子。
※7．脱下的不育小花、空的颖片、内外稃、稃壳、茎叶、球果、鳞片、果翅、树皮碎片、花、线虫瘿、真菌体（如麦角、菌核、黑穗病孢子团）、泥土、砂粒、石砾及所有其它非种子物质。
二、净种子定义
※各个属或种按表10-1净种子的定义来确定。
第三节 净度分析程序
一、重型混杂物检查
※在送验样品（或至少是净度分析试样重量的10倍）中，若有与供检种子在大小或重量上明显不同且严重影响结果的混杂物，如土块、小石块或小粒种子中混有大粒种子等，应先挑出这些重型混杂物并称重，再将重型混杂物分为其他植物种子和杂质。
二、试验样品的分取
※净度分析试验样品应按规定方法从送验样品中分取。试验样品应估计至少含有2500个种子单位的重量或不少于GB/T 3543.2—1995表1规定的重量。净度分析可用规定重量的一份试样，或两份半试样（试样重量的一半）进行分析。
※试验样品须称重，以克表示，精确至表10-2所规定的小数位数，以满足计算各种组分百分率达到一位小数的要求。
表10-2 称重与小数位数
试样或半试样及其组分 称重至下列小数位数
重量，g
1.0000以下 4
1.000～9.999 3
10.00～99.99 2
100.0～999.9 1
1000或1000以上 0
三、试样的分离、鉴定、称重
※试样称重后，通常是采用人工分析进行分离和鉴定。可以借助一定的仪器将样品分为净种子、其他植物种子和杂质。
※如放大镜和双目解剖镜可用于鉴定和分离小粒种子单位和碎片；反射光可用于禾本科可育小花和不育小花的分离，以及线虫瘿和真菌体的检查；也可以使用筛子用于分离样品中的茎叶碎片、土壤和其它细小颗粒，一般由上、下两层组成，上层为大孔筛，下层为小孔筛；
※种子吹风机可用于从较重的种子中分离出较轻的杂质，如皮壳及禾本科牧草的空小花。
※对样品仔细分析，将净种子、其他植物种子、杂质分别放入相应的容器。当不同植物种之间区别困难或不可能区别时，则填报属名，该属的全部种子均为净种子，并附加说明。
※当分析瘦果、分果、分果爿等果实和种子时（禾本科除外），只从表面加以检查，不用压力、放大镜、透视仪或其它特殊的仪器。从表面发现其中明显无种子的，则把它列入杂质。
※对于损伤种子，如没有明显地伤及种皮或果皮，则不管是空瘪或充实，均作为净种子或其他植物种子；若种皮或果皮有一裂口，必须判断留下的部分是否超过原来大小一半，如不能迅速作出决定，则将种子单位列为净种子或其他植物种子。
※分离后各组分分别称重（g）。
四、结果计算和数据处理
（一）称重计算
※分析结束后将净种子、其他植物种子和杂质分别称重。称量精确度与试样称重时相同。然后将各组分重量之和与原试样重量进行比较，核对分析期间物质有无增失，如果增失超过原试样重量的5%，必须重做；
※如增失小于原试样重量的5%，则计算各组分百分率。各组分百分率的计算应以分析后各种组分的重量之和为分母，而不用试样原来的重量。若分析的是全试样，各组分重量百分率应计算到一位小数。若分析的是半试样，各组分的重量百分率应计算到二位小数。
送验样品有重型混杂物时，最后净度分析结果应按如下公式计算：
净种子：
其他植物种子：
杂质：
式中：M—送验样品的重量，g；
m—重型混杂物的重量，g；
m 1—重型混杂物中的其他植物种子重量，g；
m2—重型混杂物中的杂质重量，g；
P1—除去重型混杂物后的净种子重量百分率，%；
I1—除去重型混杂物后的杂质重量百分率，%；
0S1—除去重型混杂物后的其他植物种子重量百分率，%。
最后应检查：（P2+I2+0S2）=100.0%。
（二）容许差距
※1. 半试样
※如果分析为两份半试样，分析后任一组分的相差不得超过表10-4(GB/T 3543.3-1995中表2) 第3栏或第4栏中所示的重复分析间的容许差距。若所有组分的实际差距都在容许范围内，则计算各组分的平均值。
※如差距超过容许范围，则按下列程序处理：
※（1）再重新分析成对样品，直到一对数值在容许范围内为止（但全部分析不必超过四对）。
※（2）凡一对间的相差超过容许差距两倍时，均略去不计。
※（3）各种组分百分率的最后记录，应从全部保留的几对加权平均数计算。
※2. 试样
※如在某种情况下有必要分析第二份试样时，两份试样各组分的实际差距不得超过表10-4第5栏或第6栏中的容许差距。若所有组分都在容许范围内，取其平均值。
※如超过，再分析一份试样，若分析后的最高值和最低值差异没有大于容许误差2倍时，填报三者的平均值。如果这些结果中的一次或几次显然是由于差错而不是由于随机误差所引起的，需将不准确的结果去除。
※3. 最终结果的修正
※ 各种组分的最终结果应保留一位小数，其和应为100.0%，小于0.05%的微量组分在计算中应除外。如果其和是99.9%或100.1%，那么从组分最大值（通常是净种子部分）增减0.1%。如果修约值大于0.1%，那么应检查计算有无差错。
※4. 净度分析实例
※[例1] 对某批蕹菜种子送验样品1030g进行净度分析，测得重型其他植物种子1.430g，重型杂质4.720g。
※从送验样品分取两份半试样，第一份半试样为64.65g，测得净种子64.22g，其他植物种子0.0510g，杂质0.3700g；第二份半试样为62.52g，测得净种子62.15g，其他植物种子0.0212g，杂质0.3203g；求蕹菜种子的净度及其他各组分的百分率。
※先求净种子、其他植物种子、杂质的百分率（P1、0S1、I1），
以上三种组分相加值正好等于100.0%，不需修正，即该样品净度分析的最终结果为：净种子98.8%，其他植物种子0.2%，杂质1.0%。
※[例2] 分析两份无稃壳种的半试样，检测结果为：第一份净种子重量百分率为98.50％，其他植物种子为1.00％，杂质为0.50％；第二份净种子为98.30％，其他植物种子为1.40％，杂质为0.30％。
※先计算两份净种子重量百分率的平均值为：(98.50十98.30)／2＝98.40，用98.40查表10-4（GB／T 3543.3一1995中表2）的容许误差为1.29，而两份半试样间的差异为：98.50—98.30＝0.2，重复间的净种子重量百分率在容许范围内。依同样方式再检查其他植物种子、杂质的重量百分率。
※[例3] 分析两份无稃壳种的半试样，进行核对检查，其净种子重量百分率检测结果为：第一份半试样为97.30％，第二份半试样为97.70％。
※两份半试样的平均百分率为：(97.30十97.70)／2＝97.50，用97.50查GB／T 3543.3—1995中表4的容许误差为1.33，而两份半试样间的差异为：97.70—97.30＝0.40，分析在容许范围内，所以核对检查的结果是好的。
※[例4] 由两个不同检验员在同一检验室分别对两份水稻试验样品进行核对检查，其检测结果为：第一份净种子重量百分率为98.6％，第二份为94.9％。
※先计算这两份试样结果的平均值，：(98.6十94.9)／2＝96.75。用96.75查GB／T 3543.3—1995中表4，查得容许误差为1.80。而两份试样间的差异为：98.6—94.9＝3.7，超过了1.80的容许误差。
※出现这种情况，需再分析第二对试样，其净度分析结果为：第三份净种子重量百分率为98.7％，第四份为97.1％。先计算这两份试样结果的平均值：(98.7十97.1)／2＝97.9。用97.9查GB／T 3543.3一1995中表4，查得容许误差为1.47。而两份试样间的差异为98.7—97.1＝1.6，超过了1.47的容许误差。
※这样还需分析第三对试样，其净度分析结果为：第五份净种子重量百分率为98.4％，第六份为98.9％。这两份试样结果的平均值：(98.4十98.9)／2＝98.65。用98.65查GB／T 3543.3—1995中表4,查得容许误差为1.21。而两份试样间的差异为98.9—98.4＝0.5，未超过1.2的容许误差。
※最后的填报结果还得判别这三者有无可比性：
※第一对的两份试样间的差异为3.7，而二倍的容许误差为3.6，仍然超过，应去掉这一对；
※第二对的两份试样间的差异为1.6，而二倍的容许误差为2.9，差异没有超过容许误差，应保留；
※第三对的两份试样间的差异为0.5，而二倍的容许差异为2.4，应保留。
※这样最后的填报结果将是第二对和第三对的加权平均值。
五、结果表示
※净度分析的结果应保留1位小数，各种组分的百分率总和必须为100.0%。若一种组分的结果为零，须在适当空格内用“-0.0-”表示。若其一组分少于0.05%，则填报“微量”。若需将净度分析结果与规定值相比较，其容许差距可查表10-4。
※当测定某一类杂质或某一种其他植物种子的重量百分率达到或超过1.0%时，该种类应在结果报告中注明。
六、包衣种子的净度分析程序
※包衣种子的净度分析可用不脱去包衣材料的种子和脱去包衣材料的种子两种方法进行分析。
※严格地说，一般不对丸化种子、包膜种子和种子带内的种子进行净度分析。换言之，通常不采用脱去包衣材料的种子和在种子带上剥离种子进行净度分析，但是如果送验者提出要求或者是混合种子，则应脱去包衣材料，再进行净度分析。
（一）不脱去包衣材料的净度分析
※1.试样的分取
※试样重量见GB/T 3543.7表3和表4。用分样器分取一份不少于2500粒种子的试样或两份这一重量一半的半试样，种子带为100粒。将试样或半试样称重，以克表示，小数位数达到GB/T 3543．3中表1的要求。
※2.试样的分离和称重
※种子带不需要进行分离，而丸化种子或包膜种子称重后则须按下列标准将丸化种子(或包膜种子)的试验样品分为净丸化种子(净包膜种子)、未丸化种子(未包膜种子)和杂质三种组分：
※（1）净丸化种子(净包膜种子)的标准：
※①含有或不含有种子的完整丸化粒(包膜粒)；
※②丸化(包膜)物质面积覆盖占种子表面一半以上的破损丸化粒(包膜粒)，但明显不是送验者所述的植物种子或不含有种子的除外。
※（2）未丸化(未包膜)种子标准：
※①任何植物种的未丸化(未包膜)种子；
※②可以看出其中含有一粒非送验者所述植物种的破损丸化(包膜)种子；
※③可以看出其中含有送验者所述植物种，而它又未归于净丸化(包膜)种子中的破损丸化(包膜)种子。也就是说，丸化(包膜)物质面积覆盖占种子表面一半或一半以下的破损丸化粒(包膜粒)。
※（3）杂质标准：
※①已经脱落的丸化(包膜)物质；
※②明显没有种子的丸化(包膜)碎块；
※③按GB/T 3543.3—1995附录A中A2.3规定列为杂质的任何其他物质。
※这三种组分分离后，分别称重。
※3.种真实性的鉴定
※为了核实丸化(包膜)种子中所含种子是否确实属于送验者所述的种，应从丸化(包膜)种子净度分析后的净丸化(净包膜)种子部分中取出100颗丸粒(包膜粒)，用洗涤法或其他方法除去丸化(包膜)物质，然后测定每粒种子所属的种。同样，从种子带中取出100粒种子，鉴定每粒供试种子真实性。
※4.结果计算和表示、报告
※计算与填报净丸化粒(净包膜粒)、未丸化粒(未包膜粒)和杂质的重量百分率，程序同GB/T 3543.3的内容。
※（二）脱去包衣材料和种子带上剥离种子的净度分析
※1.脱去包衣材料
※除去包衣种子的包衣材料的方法是采用洗涤法。将不少于2500颗丸化种子或包膜种子，置于细孔筛内，浸入水中震荡，使包衣材料沉于水中。筛孔大小规格为：上层用1.0mm，下层用0.5mm。丹麦种子检验站使用磁力搅拌器，美国采用pH值8—8.4的稀氢氧化钠溶液溶解，也能达到较好效果。
※当要求从种子带上剥离的种子进行分析时，应小心地将试样的制带材料与纸带分开和剥去。如果种子带材料为水溶性，则可将其湿润，直至种子分离出来。当在种子带内的种子是丸化种子或包膜种子时，则按上述的洗涤法去掉丸化或包膜材料。
※2.种子干燥、称重
※脱去包衣材料后或从种子带中取出湿润的种子放在滤纸上干燥过夜，再放入干燥箱内干燥，按GB/T 3543.6—1995中的5.3条“高水分预先烘干法”干燥成半干试样，不再进行5.1或5.2条的方法烘干，然后称取干燥后的种子重量。
※3.分离、鉴定和称重
※按GB/T 3543.3—1995附录A中A2．3规定的标准进行净度分析，将种子试样分成净种子、其他植物种子和杂质三种组分，同时对样品中其他植物种的种类进行鉴定。分离后分别对各种组分称重，计算各种组分百分率。
※4.结果计算和表示、报告
※计算与填报净种子、其他植物种子和杂质的重量百分率，程序同GB/T 3543.3的内容。不考虑丸化、包膜材料、制带材料，只有在提出检测要求时，才考虑填报其百分率。
第四节 其他植物种子数目测定
一、测定方法
(1)完全检验
※试验样品不得小于25000个种子单位的重量或GB/T 3543.2表1所规定的重量。
※借助于放大镜、筛子和吹风机等器具，按规定逐粒进行分析鉴定，取出试样中所有的其他植物种子，并数出每个种的种子数。当发现有的种子不能准确确定所属种时，允许鉴定到属。
(2)有限检验
※有限检验的检验方法同完全检验，但只限于从整个试验样品中找出送验者指定的其他植物的种子。如送验者只要求检验是否存在指定的某些种，则发现一粒或数粒种子即可。
(3)简化检验
※如果送验者所指定的种难以鉴定时，可采用简化检验。简化检验是用规定试验样品重量的五分之一(最少量)对该种进行鉴定。简化检验的检验方法同完全检验。
二、试样称重
※供测定其他植物种子的试样通常为净度分析试样重量的10倍，即约25000个种子单位的重量，或与送验样品重量相同。
※当送验者所指定的种较难鉴定时，可采用简化检验，即用规定试样量的1/5进行鉴定。
三、分析测定
※分析时可借助放大镜、吹风机和光照设备等。根据送验者的要求对试样逐粒观察，取出所有其他植物的种子或某些指定种的种子，并数出每个种的种子数。
※当发现有的种子不能准确鉴定到所属种时，可鉴定到属。
※如为有限检验，那么只须找出送验者指定的其他植物种的种子，只要发现一粒或数粒即可。
四、结果计算
※结果用实际测定试样中所发现的种子数表示。但通常折算为样品单位重量（每千克）所含的其他植物种子数，以便比较。
当需要判断同一检验站或不同检验站对同一批种子的两个测定结果之间是否有明显差异时，可查其他植物种子计数的容许差距表（表10-5）。先根据两个测定结果计算出平均数，再按平均数从表中找出相应的容许差距。进行比较时，两个样品的重量须大体相等。
※其他植物种子数目测定实例：
※[例1] 在1000g试样的种子中发现野燕麦66粒，而另一份1000g试样的种子中发现野燕麦50粒，试问这两次测定是否一致?
※计算其他植物种子平均粒数为：(66十50)／2＝58，查GB/T 3543.3—1995中表6得容许误差为22，而两份试样间的差异为66—50＝16，因此这两份测定结果是可比的。最后填报的检测结果为：在2000g总重量样品中，有116粒野燕麦种子(注意最后填报不用平均值)。
※[例2] 种子公司测定一种子批的某一种类的其他植物种子数目为6粒，并进行标签出售，而在同一种子批中由种子检验机构扦取样品并测得的结果为同一种类的其他植物种子数目为12，试问该标签标注值是否有效?
※先求这两次测定的平均值为9，查GB/T 3543.3—1995中表7获知容许误差为8，而两次测定间差距为6，所以第二次测定结果没有明显比第一次差，标签的标注值可以接受。
※[例3] 如果例2中第一次测定结果为零，而第二次测定结果为7，可以通过类似的计算，得出标签的标注值不可以接受。
※[例4] 如果例2中第一次测定结果为7，而第二次测定结果为零，就不必进行计算可以得出标签的标注值可以接受。
五、结果表示
※将测定种子的实际重量、学名和该重量中找到的各个种的种子数填写在结果报告单上，并注明用完全检验、有限检验或简化检验。
六、包衣种子其他植物种子数目测定程序
※1.试验样品
※供其他植物种子数目测定的试验样品数量不少于GB/T 3543.7表3和表4的规定，丸化种子或包膜种子可将试验样品分成两个半试样。
※2.除去包衣材料
※用上一节所述的洗涤法除去包衣材料或制带物质，但种子不一定要干燥。
※3.分析鉴定
※从试样中找出所有其他植物种子，或者按送验者的要求找出某些指定种的种子。
※4.结果计算、表示、报告
※测定结果用供检丸化种子或包膜种子的实际重量和大致粒数中所发现的属于所述每个种或类型的种子数，或者用供检种子带长度中所发现种籽粒数表示。同时还须计算每单位重量、单位长度(即每千克、每米)粒数。
※当有必要判定同一检验站或不同检验站的两个测定结果是否存在显著差异时，可查表10-5（GB/T 3543.3—1995表6）其他植物种子数目测定的容许差距表。但在比较时，两个样品的重量须大体相同。
※表10-5 其他植物种子数目测定的容许差距
第十一章 水分测定
第一节 水分测定概述
一、种子水分含义
※种子水分是指种子内自由水和束缚水的重量占种子原始重量的百分率。
二、水分测定和种子油分的关系
㈠种子水分和油分的性质以及与水分测定的关系
1. 种子水分 种子中的水分按其特性可分为自由水和束缚水两种。
⑴自由水
※自由水是生物化学的介质，存在于种子表面和细胞间隙内，具有一般水的特性，可作为溶剂，100℃沸点，0℃结冰，易受外界环境条件的影响，容易蒸发。因此在种子水分测定前，须采取措施尽量防止这种水分的损失。
※如送检样品必须装在防湿容器中，并尽可能排除其中空气；样品接收后立即测定（如果样品接收当天不能测定，应将样品贮藏在4～5℃的条件下，不能在低于0℃的冰箱中贮存）；测定过程中的取样、磨碎、称重须操作迅速；避免蒸发（磨碎转速不能过快，不磨碎种子这一过程所费的时间不得超过2min）；高水分种子自由水含量更高，更易蒸发，需磨碎的高水分种子须用高水分预先烘干法测定水分。
⑵束缚水
※束缚水与种子内的亲水胶体如淀粉、蛋白质等物质中的化学基团牢固结合，水分子与这些胶体物质中的化学基团，如羧基、氨基与肽基等以氢键或氧桥等相连接。不能在细胞间隙中自由流动，不易受外界环境条件影响。
※种子烘干时，水分开始蒸发较快，这是由于自由水蒸发容易，随着烘干的进程，蒸发速度逐渐缓慢，这是由于束缚水被种子内胶体牢固结合，因此用烘干法设计水分测定程序时，应通过适当提高温度（如130℃）或延长烘干时间才能把这种水分蒸发出来。
※种子中有些化合物如糖类中，含有一定比例的能形成水分的H和O元素。通常将种子有机物分解产生的水分（H和O元素）称之为化合水或分解水。这不是真正意义上的水分。如果失掉这种水分，糖类就会分解变质。如用较高温度（130℃）烘干时间过长，或过高的温度（超过130℃），有可能使样品烘焦，放出分解水，而使水分测定百分率偏高。
2. 油分
※含亚麻酸等不饱和脂肪酸较高的油料种子（如亚麻），如果种子磨碎，或剪碎，或烘干温度过高，不饱和脂肪酸易氧化，使不饱和键上结合了氧分子，增加了样品重量，会使水分测定结果偏低，因此，应严格控制烘干温度，并且不应磨碎或剪碎。
※一些蔬菜种子和油料种子含有较高的油分，油分沸点较低，尤其是芳香油含量较高的种子，温度过高就易挥发，使样品减重增加，测得的水分百分率偏高。
※综上所述，测定种子水分必须保证使种子中自由水和束缚水充分而全部除去，同时要尽最大可能减少氧化、分解或其他挥发性物质的损失，尤其要注意烘干温度、种子磨碎和种子原始水分等因素的影响。
三、水分测定方法和仪器设备
（一）水分测定方法和干燥原理
※目前常用的种子水分测定法是烘干减重法（包括烘干法、红外线烘干法）和电子水分仪速测法（包括电阻式、电容式和微波式水分测定仪）。一般正式报告需采用烘箱标准法进行种子水分测定，而在种子收购、调运、干燥加工等过程中可以采用电子水分速测仪测定种子水分。
※烘干法测定种子水分利用的主要仪器是电热干燥箱。根据样品烘干后失去水分的重量按照下列公式即可计算出样品的含水量：
(二)水分测定仪器设备
1. 干燥箱
※干燥箱有电热恒温干燥箱（电烘箱）和真空干燥箱。目前常用的是电热恒温干燥箱，它主要由箱体（保温部分）、加热部分和恒温部分组成。箱体工作室内装有可移动的多孔铁丝网，顶部孔内插入200℃温度计，以测得工作室内的温度。用于测水分的电烘箱，应是绝缘性能良好，箱内各部位温度均匀一致，能保持规定的温度，加温效果良好，即在预热至所需温度后，放入样品，可在5～10min内回升到所需温度。
2. 电动粉碎机
※用于磨碎样品，常用的有滚刀式和磨盘式两种。要求粉碎机结构密闭，粉碎样品时尽量避免室内空气的影响，转速均匀，不致使磨碎样品时发热而引起水分损失，可将样品磨至规定细度。
3. 分析天平
※称量快速，感量达到0.001g。
4. 样品盒
※常用的是铝盒，盒与盖标有相同的号码，紧凑合适，规格是直径4.6cm，高2～2.5cm，盛样品4.5～5g，可达到样品在盒内的厚度每cm2不超过0.3g的要求。
5. 干燥器
※用于冷却经过烘干的样品或样品盒。干燥器的盖与底座边缘涂上凡士林后密闭性能良好，打开干燥器时要将盖向一边推开。干燥器内需放干燥剂，一般使用变色硅胶，其吸湿率为31%。在未吸湿前呈蓝色，吸湿后呈粉红色，因此极易区分其是否仍有吸湿能力。吸湿后的变色硅胶可通过烘干将水分除去，以恢复吸湿性能。
6. 其他
※需要有洗净烘干的磨口瓶、称量匙、粗纱线手套、毛笔、坩埚钳等。
第二节 烘干减重法水分测定程序
一、测定方法
（一）低恒温烘干法
※低恒温烘干法是将样品放置在103±2℃的烘箱内烘干8h，适用于葱属、花生、芸苔属、辣椒属、大豆、棉属、向日葵、亚麻、萝卜、蓖麻、芝麻、茄子。
1. 铝盒恒重
※在水分测定前预先准备。将待用铝盒（含盒盖）洗净后，于130℃的条件下烘干1h，取出后冷却称重，再继续烘干30min，取出后冷却称重，当两次烘干结果误差小于或等于0.002g时，取两次重量平均值；否则，继续烘干至恒重。
2. 预调烘箱温度
※按规定要求调好所需温度，使其稳定在103±2℃，如果环境温度较低时，也可适当预置稍高的温度。
3. 样品制备
※水分送验样品必须装在一个完整的防湿容器中，并且尽可能排除其中空气。测定应尽可能在样品接收后立即开始，防止样品水分变化。取样时先将密闭容器内的样品充分混合，从中分别取出两个独立的试验样品15～25g，放入磨口瓶中。需磨碎的样品按表11-1要求进行处理后立即装入磨口瓶中备用，最好立即称样，以减少样品水分变化。剩余的送验样品应继续存放在密闭容器内，以备复检。
4. 称样烘干
※将处理好的样品在磨口瓶内充分混合，用感量0.001g的天平称取4.000～5.000g试样两份，分别放入经过恒重的铝盒，盒盖套于盒底下，记下盒号、盒重和样品的实际重量，摊平样品，立即放入预先调好温度的烘干箱内，铝盒距温度计水银球2～2.5cm，然后关闭箱门。当箱内温度回升至规定温度时开始计时，烘干8 h后，戴好纱线手套，打开箱门，取出铝盒，迅速盖好盒盖，放在干燥器中冷却到室温（约需30～45分钟）后称重。
表11-1 必须磨碎的种子种类及磨碎细度
（二）高恒温烘干法
※此法是将样品放在130～133℃的条件下烘干1h。适用于芹菜、石刁柏、燕麦属、甜菜、西瓜、甜瓜属、南瓜属、胡萝卜、大麦、莴苣、苜蓿属、番茄、烟草、水稻、菜豆属、豌豆属、小麦属、菠菜、玉米。测定程序、计算水分公式与低恒温烘干法相同，须磨碎种子种类与细度详见表3-1。
※此法是在较高的温度下，加速样品内的水分蒸发，在短时内测得样品水分，因此使用时应严格控制烘干的温度和时间。如温度过高或时间过长，易使种子中的干物质氧化而降低样品重量，使水分测定结果偏高。
（三）高水分预先烘干法
※当需磨碎的禾谷类作物种子水分超过18%，豆类和油料作物种子水分超过16%时，必须采用预烘法。这是因为高水分种子不易在粉碎机上磨至规定细度，若要磨到规定细度，则需较长时间，加之高水分种子自由水含量高，磨碎时水分容易散发，影响种子水分测定结果的正确性，故先将整粒种子作初步烘干，然后进行磨碎或切片，测定种子水分，具体步骤如下：
※称取两份样品各25.00±0.02g，置于直径大于8cm的样品盒中，在103±2℃烘箱中预烘30min(油料种子在70℃预烘1h)。取出后放在室温冷却和称重。此后立即将这两个半干样品分别磨碎，并将磨碎物各取一份样品按低恒温或高恒温烘干方法进行测定。
二、结果计算
※根据烘后失去水的重量计算种子水分百分率，按下列公式计算并修约到小数点后一位。
※式中：1----样品盒和盖的重量（g）；
※2----样品盒和盖及样品的烘前重量（g）；
※3----样品盒和盖及样品的烘后重量（g）。
※若用预先烘干法，样品的总水分含量可用第一次烘干和第二次烘干所得的水分结果换算样品的原始水分。样品的总水分含量为：
※式中：1----第一次整粒种子烘后失去的水分（%）；
※2----第二次磨碎种子烘后失去的水分（%）。
三、结果报告
※若一个样品的两次测定之间的差距不超过0.2%，其结果可用两次测定值的算术平均数表示。
※否则，需重做两次测定。结果填报在检验结果报告单的规定空格中，精确度为0.1%。
第三节 水分快速测定方法
※种子水分快速测定主要采用电子仪器，可分为三类，即电阻式、电容式和微波式。各种类型都有多种型号仪器，使用方法也各不相同，以下介绍常用的电阻式和电容式水分测定仪。
一、电阻式水分测定仪测定原理
※将种子放在电路中，作为一个电阻，在一定的范围内，种子水分高，溶解的物质增多，电离度增大，电流较大；反之，电流较小。但二者之间亦非完全直线关系。根据这个原理，可以测定种子水分。当种子水分太低或太高时，相当于断路或短路，仪器就不能测出。由于不同作物种子的化学组成不同，含有相同水分时，其自由水和束缚水的比例不同，溶解的可溶性物质多少不同，电阻不完全一致，所以操作前应先选择所测作物的特定表盘或按钮。样品电阻的大小同时受到待测样品温度的影响。当水分一定时，温度高，电离度增加，电阻降低，测定值偏高；反之，则低。一般仪器以20℃为准，高于或低于20℃时都要对读数进行校正，有些仪器已设定自动校正。
二、电容式水分测定仪测定原理
※当被测种子样品放入水分测定仪传感器中时，组成电容的一部分，电容量的数值将取决于该样品的介电常数，而种子样品的介电常数主要随种子水分的高低而变化（空气的介电常数约为1，种子中干物质为10，水为81），因此，通过测定传感器的电容量，就可间接地按样品容量与水分的对应关系，测定被测样品的水分。
※使用电子仪器法测定种子水分具有快速、简便的特点，尤其适于种子收购入库及贮藏期的一般性检查，可以减少大量的工作。但这类仪器的使用也有其局限性，应注意以下两点：
※第一，使用电子仪器测定水分前，必须和烘干减重法进行校对，以保证测定结果的正确性，并注意仪器性能的变化，及时校验。
※第二，样品中的各类杂质应先除去，样品水分不可超出仪器量程范围，测定时所用样品量需符合仪器说明要求。
第十二章 重量测定
第一节 概述
一、种子千粒重的含义
※种子重量测定是指测定一定数量种子的重量，通常是指测定1 000粒种子的重量，即千粒重。
※种子千粒重（the weight of 1 000 seeds）是指种子质量标准规定水分的1 000粒种子的重量，以克为单位。
※千粒重测定原则是从充分混合的净种子中随机数取一定数量的种子，称其重量，由于不同种子批在不同地区和不同季节，其水分差异很大，为了便于比较不同水分下的种子千粒重，将实测水分换算成相同的规定水分条件下的1 000粒种子的重量
二、千粒重测定的目的和意义
种子千粒重对农业生产具有重要意义，主要体现在以下几方面：
1．种子千粒重反映种子的饱满程度，是种子质量的指标之一。一般来说，在标准水分条件下，同一作物品种，千粒重高的种子质量就好，通常具有充实、饱满、均匀等优良特性，播种后往往表现出苗整齐，幼苗生长健壮。
2．根据千粒重，可以做到精量播种，节约用种。在农业生产上确定作物播种量时，可根据种植株数或栽插密度、种子千粒重和发芽率等，准确计算实际播种量。
3．千粒重是作物产量构成的要素之一。在预测作物产量时，要做好千粒重测定。如水稻大田测产时，根据有效穗数、每穗实粒数和千粒重，可计算理论产量。
另外，粒重是作物品种的主要农艺性状之一，同一作物不同品种千粒重不同，但同一品种的千粒重基本上是一致的。
第二节 测定程序
一、百粒法测定程序
1．数取试样
※从净度分析后充分混合的净种子中，随机数取试验样品8个重复，每个重复100粒。
2．试样称重
※8个重复分别称重（g），称重的小数位数与GB/T 3543.3—1995《农作物种子检验规程 净度分析》的规定相同。
3．检查重复间的容许变异系数，计算实测千粒重
※按下列公式计算8个重复的标准差、平均重量及变异系数：
如带有稃壳种子的变异系数不超过6.0，其他种类种子的变异系数不超过4.0。
※如果变异系数未超过上述的容许变异系数，则可计算实测的千粒重；如果变异系数超过上述限度，则再测定8个重复，并计算16个重复的标准差，凡与平均数之差超过两倍标准差的重复略去不计。
※将8个或8个以上的每个重复100粒种子的平均重量乘以10即为实测千粒重。
4．换算成规定水分下的千粒重
※按公式（12-4）换算成国家种子质量标准规定水分的千粒重
实测千粒重（g）×[1－实测水分（%）]
千粒重（规定水分，g）＝1－规定水分（%） ………（12-4）
5．结果报告
※将规定水分下的种子千粒重测定结果填入结果报告单中，其保留小数的位数与测定时所保留的小数位数相同。
二、千粒法测定程序
1．数取试样
从净度分析后充分混合的净种子中，随机数取试验样品2个重复，每个重复大粒种子为500粒、中小粒种子为1 000粒。
2．试样称重
2个重复分别称重(g),称重的小数位数与GB/T 3543.3－1995《农作物种子检验规定 净度分析》的规定相同。
3．检查重复间容许差距，计算实测千粒重
※两份重量的差数与平均数之比不应超过5%，如果超过，则需再分析第三份重复，直至达到要求。
※中小粒种子1 000粒测定的，取差距小的两份重复的重量平均数即为实测千粒重；大粒种子500粒测定的，取差距小的两份重复的重量平均数乘以2即为实测千粒重。
4．换算成规定水分下的千粒重
※方法同百粒法，按公式（12-4）换算成国家种子质量标准规定水分的千粒重。
5．结果报告
※将规定水分下的种子千粒重测定结果填入结果报告单中，其保留小数的位数与测定时所保留的小数位数相同。
三、全量法测定程序
1．数取试样总粒数
※数取净度分析后的全部净种子的种子总粒数。
2．试样称重
※称其重量（g），称重的小数位数与GB/T 3543.3-1995《农作物种子检验规定 净度分析》的规定相同。
3．换算成在规定水分下的千粒重
※将上述的试样重量和粒数，按下列公式求得种子的实测千粒重：
实测千粒重（g）=
式中：W-----净种子总重量；n----净种子总粒数
方法同百粒法, 按公式（12-4）换算成国家种子质量标准规定水分的千粒重。
4．结果报告
※将规定水分下的种子千粒重测定结果填入结果报告单中，其保留小数的位数与测定时所保留的小数位数相同。
※丸化种子的重量测定按上述三种方法任选一种测定，计算净度分析后的净丸化粒1000粒的重量。
第十三章 发芽试验
第一节 概述
一、发芽试验的目的和意义
※发芽试验的目的是测定种子批的最大发芽潜力，据此可比较不同种子批的质量，也可估测田间播种价值。
二、有关术语
※39．50%规则(50% rule)
※如果整个子叶组织或初生叶有一半或一半以上的面积具有功能，则这种幼苗可列为正常幼苗；如果一半以上的组织不具备功能，如缺失、坏死、变色或腐烂，则为不正常幼苗。
※当从子叶着生点到下胚轴有损伤和腐烂的迹象时，这时不能采用50%规则。当初生叶形状正常，只是叶片面积较小时，则不能应用50%规则。
第二节 发芽设备
一、发芽箱和发芽室
※发芽箱是提供种子发芽所需的温度、湿度或水分、光照等条件的设备。发芽箱可分为两类：一类是“干”型，只控制温度不控制湿度，其中又可分为恒温和变温两种；另一类是“湿”型，既控制温度又控制湿度。
※我国目前常用的发芽箱多数属于“干”型，如光照变温发芽箱。它们有一个保温良好的箱体，箱的上下部分别设有加热系统和制冷系统，可根据发芽技术要求升温、降温或变温。箱体后部装有鼓风机，箱内中间配有数层发芽架，箱体的内壁装有日光灯。其特点是可调节和控制温度和光照条件，是一种功能较为完备的发芽箱。
※在选用发芽箱时，应考虑以下因素：①控温可靠、准确、稳定，箱内上、下各部位温度均匀一致；②致冷致热能力强，变温转换要能在1 h内完成；③光照强度至少达到750～1 250 lx（勒克司）；④装配有风扇，通气良好；⑤操作简便等。
※发芽室可以认为是一种改进的大型发芽箱，其构造原理与发芽箱相似，只不过是容量扩大，在其四周置有发芽架。发芽室跟发芽箱一样，也有“干型”和“湿型”，干型发芽室放置的培养皿需加盖保湿。
二、数种设备
※为使合理置床和提高工作效率，可使用数种设备。目前使用的数种设备主要有活动数种板和真空数种器等。
1．活动数种板
※数种板由固定下板和活动上板组成。其板面大小刚好与所数种的发芽容器相适应。上板和下板均开有与欲数种子大小和形状相适应的50或25个孔。固定下板有糟，使活动上板定位。
※数种板适用于大粒种子，如玉米、大豆、菜豆和脱绒棉子等种子的数种和置床。
※操作时，数种板放在发芽床上，把种子散在板上，并将板稍微倾斜，以除去多余的种子。然后进行核对，当所有孔装满了种子并每孔只有一粒种子时，移动上板，使上板孔与下板班孔对齐，种子就落在发芽床的适当位置。
2．真空数种器
※通常由数种头、气流阀门、调压阀、真空泵和连接皮管等部分组成。数种头有圆形、方形和长方形，其数种头面积大小刚好与所用的培养皿或发芽盒的形状和大小相适应。其面板设有100、或50个数种孔，孔径大小也与种子类型相适应。
※真空数种器主要适用于小、中粒种子，如水稻、小麦种子的数种和置床。
※操作时，在未产生真空前，将种子均匀撒在数种头上，然后接通真空泵，倒去多余种子，并进行核对，使全部孔都放满种子，并使每个孔中只有一粒种子。然后将数种头倒转放在发芽床上。应避免将数种头 直接 嵌入种子，防止有选择选取重量较轻的种子。
※必须注意的是，使用数种设备应 确保 置床的种子是随机选取的。
三、发芽器皿
※根据GB/T 3543.4－1995《农作物种子检验规程 发芽试验》的要求，发芽试验种子置床培养至幼苗主要构造能清楚鉴定的阶段，以便鉴定正常幼苗和不正常幼苗，因此，要求发芽器皿（如培养皿）透明、保湿、无毒，具有一定的种子发芽和发育的空间，确保一定的氧气供应，使用前要清洗和消毒。
第三节 发芽介质与发芽床
※发芽床是供发芽测定的容器，由供给种子发芽水分和支撑幼苗生长的介质和盛放介质的发芽器皿构成。种子检验规程规定的发芽床主要有纸床、砂床以及土壤发芽床等种类。各种发芽床都应具备保水、通气性好，无毒质，无病菌和具一定强度的基本要求。
一、发芽介质及其要求
1．纸
※采用纸作为发芽介质是种子发芽试验中应用最多的一类发芽床。供作发芽床用的纸有专用发芽纸、滤纸等。一般来说，发芽纸应满足以下要求：①持水力强。吸水良好的纸，不但吸水要快（可将纸条下端浸入水中，2 min内水上升30 ㎜或以上的纸为好），而且持水力也要强，使发芽试验期间具有足够的保水能力，以保证对种子发芽不断供应水分。②无毒质。纸张必须无酸碱、染料、油墨及其他对发芽有害的化学物质。纸张的pH值应在6.0～7.5范围内。③无病菌。因为纸上带有真菌或细菌会导致病菌滋长而影响种子发芽，所以所用纸张必须清洁干净，无病菌污染。④纸质韧性好。纸张应具有多孔性和通气性，并具有一定强度，以免吸水时糊化和破碎，并在操作时不致撕破和发芽时种子幼根不致穿入纸内，便于幼苗的正确鉴定。
2．砂
※采用砂作为发芽介质是种子发芽试验中较为常用的一类发芽床。一般加水量为其饱和含水量的60%～80%水分。通常也可采用简便方法调配，即100 g干砂中加入18～26 mL的水，充分拌匀后，达到手捏成团，放手即散开，不能出现手指一压就出现水层。
※应注意，须将所用砂子加水拌匀后再分放入培养盒，不能将干砂先倒入培养盒，然后加水拌匀。这种拌砂法往往会造成砂中水分多、孔隙少，氧气不够，影响正常发芽。
3．土壤
※供作发芽试验用的土壤其土质必须疏松良好、不结块（如土质粘重应加入适量的砂），无大颗粒。土壤中应基本上不含混入的种子、细菌、真菌、线虫或有毒物质。使用前，必须经过高温消毒，一般不重复使用。
※湿润发芽床的水质应纯净，不含有机杂质和无机杂质，无毒无害，pH值在6.0～7.0范围内。
二、发芽床的种类和用法
1．纸床
（1）纸上（简称TP）
※纸上是指种子放在一层或多层纸上发芽，可采用下列三种方法：
※①在培养皿里垫上两层发芽纸，充分吸湿，沥去多余水分，种子直接置放在湿润的发芽纸上，用培养皿盖盖好或用塑料袋罩好，放在发芽箱或发芽室内进行发芽试验；
※②数种置床于湿润的发芽纸上，并将其直接放在“湿型”发芽箱的盘上，发芽箱内的相对湿度尽可能接近饱和；
※③放在雅可勃逊发芽器上，这种发芽器配有放置发芽纸的发芽盘。
（2）纸间（简称BP）
※ 纸间是指种子放在两层纸中间发芽，可采用下列两种方法：
※①在培养皿里把种子均匀置放在湿润的发芽纸上，另外用一层发芽纸松松地盖在种子上；
※②采用纸卷，把种子均匀置放在湿润的发芽纸上，再用一张同样大小的发芽纸覆盖在种子上，底部褶起2厘米，然后卷成纸卷，两端用橡皮筋扎住，竖放在培养皿或塑料筒里，套上透明塑料袋保湿，放在规定条件下发芽。
※有些种子可用短纸卷，直接放在塑料袋内包好放在发芽箱内发芽。
（3）褶裥纸（简称PP）
※把种子放在类似手风琴的具有50个褶裥的纸条内，通常每个褶裥放两粒种子，或者具有10个褶裥，每褶裥放5粒种子。将褶裥纸条放在盒内或直接放在“湿型”发芽箱内，并可用一张纸条盖在褶裥纸上面。
※规程规定使用TP或BP进行发芽的，可用这种方法代替。
2．砂床
※砂床使用方法有两种：
※①砂上（简称TS），适用于小、中粒种子。将拌好的湿砂装入培养盒中至2～3 cm厚，再将种子压入砂表层，即砂上发芽；
※②砂中（简称S），适用于中、大粒种子。将拌好的湿砂装入培养盒中至2～4 cm厚，播上种子，覆盖1～2 cm厚度（厚度取决于种子的大小）的松散湿砂，以防翘根。
※当由于纸床污染，对已有病菌的种子样品鉴定困难时，可用砂床替代纸床。有时为了研究目的和证实有疑问的幼苗鉴定，也可采用砂床。
3．土壤床
※除了规程规定使用土壤床外，当纸床或砂床上的幼苗出现中毒症状时或对幼苗鉴定发生怀疑时，或为了比较或研究目的，可采用土壤床。
※选用符合要求的土壤，经高温消毒后，加水调配适宜水分，然后再播种，并覆上疏松土层。
第四节 发芽条件及其控制
※种子发芽需要有水分、温度、氧气和光照等条件。不同作物种由于起源和进化的生态环境不同，其发芽所要求的条件也有所差异。
一、水分
※不同作物种的种子对水分的需求有差异。有些种子，如烟草、西瓜、大豆、大麦、棉花、菠菜等种子对水分较敏感，水分一多，则发芽差，甚至不发芽。而水稻、玉米等种子对水分不太敏感。
※根据发芽床和种子特性决定发芽床的加水量。如纸床，吸足水分后，沥去多余水即可；砂床加水为其饱和含水量的60%～80%(禾谷类等中小粒种子为60%，豆类等大粒种子为80%)；用土壤作发芽床，加水至手握土粘成团，手指轻轻一压就碎为宜。
※发芽期间发芽床必须始终保持湿润，并注意保持试验各重复间的水分和湿度的一致性。
二、温度
※农作物种子发芽应按表13-1规定的温度进行。发芽箱的温度在发芽期间应尽可能一致，温度变幅不应超过±2℃。
※变温是模拟种子发芽的自然环境，一般来说，变温有利于种子渗入氧气，促进酶活化，加速发芽。新收获的休眠种子对发芽温度要求特别严格，必须选用表13-1中几种恒温中的较低温度或变温。如洋葱种子发芽温度有20℃、15 ℃，则应选用15 ℃发芽，又如西瓜种子，规定温度有20～30 ℃、30 ℃、25 ℃，则应选用20～30 ℃或25 ℃恒温。陈种子，也以选用其中的变温或较低恒温发芽为好。
※当规定用变温时，通常应保持低温16 h及高温8 h。对非休眠种子，可以在3 h内完成变温。如果是休眠种子，应在1 h或更短时间内完成急剧变温或将试验移至另一个设定低温的发芽箱内。
三、氧气
※作物种的种子对氧气的需要量和敏感性是有差异的。一般来说，旱生的大粒种子，如大豆、玉米、棉花、花生等种子对氧气的需求较多；而水生的小、中粒种子则对氧气的需求较少。幼苗的不同构造对氧气的需要量和敏感性也是有差异的。种子发芽时，胚根伸长对氧气需求比胚芽伸长更为敏感。如果发芽床上水分多、氧气少，则长芽；反之，水少氧多则宜于长根。
※发芽期间应使种子周围有足够的空气，尤其是用纸卷发芽应注意纸卷需疏松，用砂床和土壤试验时，覆盖种子的砂或土壤不要压紧。
※应注意水分和通气的协调，防止水分过多在种子周围形成水膜，阻隔氧气进入种胚而影响发芽；防止水分过多或过少，导致幼苗的不均衡生长。
四、光照
※①需光型种子。发芽时必须有红光或白炽光，促使光敏色素转变为活化型，如茼蒿等。特别是这类新收获的休眠种子发芽时，必须给予光照；
※②需暗型种子。这类种子必须在黑暗条件下，其光敏色素才能达到萌发水平，如黑种草种子；
※③光不敏感型种子。在光照或黑暗条件下均能良好发芽，这类种子包括大多数大田作物和蔬菜种子。
※表13-1中大多数种的种子可在光照或黑暗条件下发芽，但最好采用光照。即便是需暗型种子，也只是发芽初期必须黑暗，随着茎叶系统的形成，为其进一步生长发育提供能量和养分的光合作用也需要光。光照条件下培养发芽，利于抑制发芽过程中霉菌生长繁殖，并有利于正常幼苗的鉴定，区分黄化和白化不正常幼苗。
※需光照的光照强度为750～1 250 lx，如在变温条件下发芽，光照应在8 h高温时进行。
第五节 发芽试验程序
一、选用发芽床
※按表13-1规定，选用其中最适宜的发芽床。每一作物种通常列出2～3种发芽床，如水稻，表13-1中规定TP、BP和S三种发芽床。一般来说，小、中粒种子可用纸上（TP）发芽床，中粒种子可用纸间（纸卷，）(BP)发芽床；大粒种子或对水分敏感的小、中粒种子宜用砂床(S)发芽。活力较差的种子，也以用砂床的效果为好。
※在选好发芽床后，按不同作物种的种子和发芽床的特性，调节其适当的湿度。
二、数种置床
1．试样来源和数量
※除委托检验外，试验样品来源必须是净种子，从充分混合的净种子中随机数取，一般数量是400粒。净种子可以从净度分析后的净种子中随机数取，也可以从送验样品中直接随机数取。
※一般小、中粒种子（如油菜、结球白菜、小麦、水稻等）以100粒为一重复，试验为4次重复；大粒种子（如玉米、大豆、棉花等）以50粒为一副重复，试验为8个副重复；特大粒的种子（如花生和蚕豆等）可以25粒为一副重复，试验为16个副重复。
※复胚种子单位可视为单粒种子进行试验，不需弄破（分开），但芫荽例外。
2．置床的要求
※种子要均匀分布在发芽床上，种子之间留有1～5倍间距，以防发霉种子的相互感染和保持足够的生长空间。每粒种子应良好接触水分，使发芽条件一致。
3．贴（放）标签
※在培养皿或其它发芽容器底盘的内侧放上或侧面贴上标签，注明样品编号、品种名称、重复序号和置床日期等，然后盖好容器盖子或套一薄膜塑料袋。
三、在规定条件下培养
※按表13-1规定的发芽条件，选择适宜的温度，虽然各种温度均为有效，但一般来说，新收获的有休眠种子和陈种子，以选用其中的变温或较低恒温发芽为好。
※关于光照条件，对需光型种子如茼蒿种子发芽时必须光照促进发芽。除需暗型种子在发芽初期应放置黑暗条件下培养，由于光照利于抑制发芽过程中霉菌生长繁殖和幼苗子叶、初生叶的光合作用，其他种子发芽时，只要条件允许，最好在光照下培养。
四、检查管理
※种子发芽期间，应进行适当的检查管理，以保持适宜的发芽条件。
※发芽床应始终保持湿润，水分不能过多或过少。温度应保持在所需温度的±2℃范围内，防止因控温部件失灵、断电、电器损坏等意外事故造成温度失控。如采用变温发芽，则应按规定变换温度。如发现霉菌滋生，应及时取出洗涤去霉。当发霉种子超过5%时，应更换发芽床，以免霉菌传开。如发现腐烂死亡种子，则应及时将其除去并记载。还应注意通气，避免因缺氧而使正常发芽受影响。
五、观察记载
1．试验持续时间
※每个种的试验持续时间详见表13-1。试验前或试验间用于破除休眠处理所需时间不作为发芽试验时间的一部分。
※如果样品在规定的试验时间内只有几粒种子开始发芽，则试验时间可延长7 d，或延长规定时间的一半。根据试验情况，可增加计数的次数。反之，如果在规定的试验时间结束前，样品已达到最高发芽率，则该试验可提前结束。
2．鉴定幼苗和观察计数
※每株幼苗都必须按规定的标准进行鉴定。鉴定要在主要构造已发育到一定时期时进行。根据种的不同，试验中绝大部分幼苗应达到：子叶从种皮中伸出(如莴苣属)、初生叶展开(如菜豆属)、叶片从胚芽鞘中伸出(如小麦属)。尽管一些种如胡萝卜属在试验末期，并非所有幼苗的子叶都从种皮中伸出，但至少在 末次 计数时，可以清楚地看到子叶基部的“颈”。
※在初次计数时，应把发育良好的正常幼苗从发芽床中拣出，对可疑的或损伤、畸形或不均衡的幼苗，通常到末次 计数。严重腐烂的幼苗或发霉的死种子应及时从发芽床中除去，并随时增加计数。
※末次 计数时，按正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子、硬实和死种子分类计数和记载。
※复胚种子单位作为单粒种子计数，试验结果用至少产生一个正常幼苗的种子单位的百分率表示。当送验者提出要求时，也可测定100个种子单位所产生的正常幼苗数，或产生一株、两株及两株以上正常幼苗的种子单位数。
六、结果计算和表示
※试验结果以粒数的百分率表示。计算时，以100粒种子为一重复，如采用50粒或25粒的副重复，则应将相邻副重复合并成100粒的重复。当一个试验的4次重复，其正常幼苗百分率都在最大容许差距范围内(表13-2)，则取其平均数表示发芽百分率。不正常幼苗、新鲜不发芽种子、硬实和死种子的百分率按4次重复平均数计算。
※结果修约按照第九章的规定。
表13-2 同一发芽试验四次重复间的最大容许差距 (2.5%显著水平的两尾测定)
七、破除休眠和重新试验
1．破除休眠
当试验结束还存在硬实或新鲜不发芽种子时，可进行处理后(详见表13-1)重新试验，如预知或怀疑种子有休眠，这些处理方法也可用于初次试验。
2．重新试验
※当试验出现下列情况时，应重新试验。
※（1）怀疑种子有休眠(即有较多的新鲜不发芽种子)时，可采用上述休眠种子处理方法重新试验，将得到的最佳结果填报，同时注明所用的方法。
※（2）由于真菌或细菌的蔓延而使试验结果不一定可靠时，可采用砂床或土壤发芽床重新试验。如有必要，应增加种子之间的距离。
※（3）当正确鉴定幼苗困难时，可采用表13-1中规定的一种或几种方法用砂床或土壤发芽床重新试验。
※（4）当发现实验条件、幼苗鉴定或计数有差错时，应采用同样方法重新试验。
※（5）当100粒种子重复间的差距超过表13-2最大容许差距时，应采用同样的方法重新试验。如果第二次结果与第一次结果相一致，即其差异不超过表13-4中所示的容许差距，则将两次试验结果的平均数填报在结果单上。如果第二次结果与第一次结果不相符合，即其差异超过表13-4所示的容许差距，则采用同样的方法进行第三次试验。用第三次结果分别与第一次结果和第二次结果进行比较，填报符合要求的结果平均数。若第三次试验仍得不到符合要求的结果，则应考虑是否人员操作（如是否使用数种设备不当，造成试样误差太大等）、发芽设备或其他方面存在重大问题，无法得到满意结果。
表13-4 同一或不同实验室来自相同或不同送验样品间发芽试验的容许差距
(2.5%显著水平的两尾测定)
八、发芽试验容许误差
※容许误差应符合GB/T 3543.1和GB/T 3543.4的规定，为了便于理解和掌握，举例说明如下。
※[例1] 某一水稻杂交种发芽试验4次重复的发芽率分别为97%、96%、98%、95%，其发芽试验条件为纸上，30 ℃恒温。
※4次重复的结果平均值为：（97+96+98+95）/4＝96.5，根据修约至最近似整数的原则，发芽率修约（0.5进为1计算）为97%。
※用97查表13-2（或GB/T 3543.4—1995中表3），查得重复间最大容许差距为7，而重复间的最大值98与最小值95之差为3，在容许差距范围内，所以本试验结果是可靠的，发芽率的填报结果为97%。
※[例2] 现测得一发芽试验4次重复的发芽率分别为：76％、65％、68％和57％，其发芽试验条件为纸上，20～30℃变温，并经硝酸钾处理。4次重复的结果平均值为：(76十65十68十57)／4＝66.5，根据进入最大值保留整数的修约原则，用67查表13-2（或GB/T 3543.4—1995中表3），查得容许误差为18，而重复间的最大差异为：76—57＝19，超过了容许误差18，所以必须进行重新试验。
※第二次的发芽试验4次重复的发芽率分别为：70％、70％、68％和72％。4次重复的结果平均值为：(70十70十68十72)／4＝70，用70查表13-2（GB/T 3543.4—1995中表3），容许误差为18，而重复间的最大差异为：72—68＝4，未超过容许误差18。
※现在再比较两次试验的一致性：(66.5十70)／2＝68.25，用68查表13-4（或GB/T 3543.4一1995中表4），其容许误差为7，而两次试验间的差距为70—66.5＝3.5，未超过容许误差。因此，发芽率的最后填报结果为68％。
※[例3] 发芽试验的第一次结果为87％、72％、68％和85％，按上述例1计算超过容许误差；第二次发芽试验为91％、84％、80％和93％，按上述例2计算仍超过容许误差；第三次为93％、87％、89％和96％，这样最后填报符合要求的第二、第三次发芽试验结果为89％。
※[例4] 有一批种子，种子销售者测定发芽率为87％，而种子消费者测定为80％，请问种子销售者的测定值可以接受吗?
※先计算两者平均值为84％，查GB/T 3543.4—1995中表5，得容许误差为7，而两者试验差距为7，所以销售者的测定值可以接受。
※[例5] 在例4中，如果第一次测定为80％，而第二次测定为88％，由于第二次测定好于第一次测定，就不必计算，得出第一次测定值可以接受。
九、结果报告
※填报发芽结果时，须填报正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子、硬实和死种子的百分率。假如其中任何一项结果为零，则将符号“－0－”填入该格中。
※填报正常幼苗等百分率时，同时还须填报采用的发芽床种类和温度、发芽试验持续时间以及为促进发芽所采用的处理方法。
第六节 幼苗鉴定
一、幼苗鉴定基础知识
1．幼苗的发育过程
※胚中着生一片子叶的称为单子叶植物，胚中着生两片子叶的称为双子叶植物。林木种子的针叶树种类（如松科等）胚中着生多个子叶称为多子叶植物。
2．幼苗的出土类型
※（1）子叶出土型（epigeal germination） 由于下胚轴伸长而使子叶和幼梢伸出地面的一种发芽习性,例如单子叶植物的洋葱（图13-2A），双子叶植物的菜豆（图13-3A）、油菜（图13-3B）、瓜类和棉花等。
※这类种子发芽时，随着胚根突出种皮，下胚轴背地性迅速伸长，将子叶和胚芽一起带出地面，此时子叶变绿展开并形成幼苗的第一个光合作用器官，接着上胚轴和顶芽发育生长。
※（2）子叶留土型（hypogeal germination） 子叶或变态子叶(盾片)留在土壤中的种皮内的一种发芽习性，例如单子叶植物的水稻、小麦（图13-2B）、玉米（图13-2C）等，双子叶植物的蚕豆、豌豆（图13-3C）等。
※这类种子发芽时，仅子叶以上的上胚轴或禾本科的胚芽鞘和中胚轴伸长，它们连同胚芽向上伸出地面，形成植株的茎叶系统，子叶或盾片留在土壤中的种皮内。与子叶出土型发芽相比，首先进行光合作用的器官是初生叶或从胚芽中长出的第一片真叶。
3．幼苗的主要构造
※幼苗的主要构造因作物种类而有明显差异，但通常由下列的一些构造的特定组合所组成：①根系，主要是初生根和次生根，在禾本科某些属中为种子根。②幼苗中轴，包括下胚轴、上胚轴、顶芽，在禾本科某些属中表现为中胚轴。③子叶，具有特定数目，1至数个。④芽鞘，禾本科中所有属。
※（1）单子叶植物幼苗的主要构造
※单子叶植物子叶出土型幼苗的主要构造包括初生根、不定根和管状子叶等，例如葱属（图13-2A）。
※单子叶植物子叶留土型幼苗的主要构造包括种子根∕初生根、次生根、不定根、中胚轴、胚芽鞘、初生叶等，例如小麦属（图13-2B）、玉米属（图13-2C）、稻属等。
※（2）双子叶植物幼苗的主要构造
※双子叶植物子叶出土型幼苗的主要构造包括初生根、次生根、下胚轴或上胚轴、子叶、初生叶和顶芽等部分，例如菜豆属（图13-3A）、芸苔属（图13-3B）等。
※双子叶植物子叶留土型幼苗的主要构造包括初生根、次生根、子叶、上胚轴、鳞片、初生叶和顶芽等，例如碗豆属（图13-3C）等。
二、幼苗鉴定总则
(一)正常幼苗的鉴定标准
正常幼苗分为：
※完整幼苗
※带有轻微缺陷的幼苗
※次生感染的幼苗
※凡符合下列类型之一者为正常幼苗。
1. 完整幼苗
※幼苗主要构造生长良好、完全、匀称和健康。因种不同，应具有下列一些构造。
※①发育良好的根系，其组成如下：
※a．细长的初生根，通常长满根毛，末端细尖；
※b．在规定试验时期内产生的次生根；
※c．在燕麦属、大麦属、黑麦属、小麦属和小黑麦属中，由数条种子根代替一条初生根。
※②发育良好的幼苗中轴，其组成如下：
※a．出土型发芽的幼苗，应具有一个直立、细长并有伸长能力的下胚轴；
※b．留土型发芽的幼苗，应具有一个发育良好的上胚轴；
※c．在出土型发芽的一些属(如菜豆属、花生属)中，应同时具有伸长的上胚轴和下胚轴；
※d．在禾本科的一些属(如玉米属、高粱属)中，应具有伸长的中胚轴。
※③具有特定数目的子叶：
※a．单子叶植物具有一片子叶，子叶可为绿色圆管状(葱属)，或变形而全部或部分遗留在种子内(如石刁柏、禾本科)；
※b．双子叶植物具有二片子叶，在出土型发芽的幼苗中，子叶为绿色，展开呈叶状；在留土型发芽的幼苗中，子叶为半球形和肉质状，并保留在种皮内。
※④具有展开、绿色的初生叶：
※a．在互生叶幼苗中有一片初生叶，有时先发生少数鳞状叶，如豌豆属、石刁柏属、巢菜属；
※b．在对生叶幼苗中有两片初生叶，如菜豆属。
※⑤具有一个顶芽或苗端。
※⑥在禾本科植物中有一个发育良好、直立的芽鞘，其中包着一片绿叶延伸到顶端，最后从芽鞘中伸出。
2. 带有轻微缺陷的幼苗
※幼苗主要构造出现某种轻微缺陷，但在其他方面能均衡生长，并与同一试验中的完整幼苗相当。有下列缺陷则为带有轻微缺陷的幼苗。
※①初生根：
※a．初生根局部损伤，或生长稍迟缓；
※b．初生根有缺陷，但次生根发育良好，特别是豆科中一些大粒种子的属(如菜豆属、豌豆属、巢菜属、花生属、豇豆属和扁豆属)、禾本科中的一些属(如玉米属、高粱属和稻属)、葫芦科所有属(如甜瓜属、南瓜属和西瓜属)和锦葵科所有属(如棉属)；
※c．燕麦属、大麦属、黑麦属、小麦属和小黑麦属中有一条强壮的种子根。
※②下胚轴、上胚轴或中胚轴局部损伤。
※③子叶(采用“50%规则”)：
※a．子叶局部损伤，但子叶组织总面积的一半或一半以上仍保持着正常的功能，并且幼苗顶端或其周围组织没有明显的损伤或腐烂；
※b．双子叶植物仅有一片正常子叶，但其幼苗顶端或其周围组织没有明显的损伤或腐烂。
※④初生叶：
※a．初生叶局部损伤，但其组织总面积的一半或一半以上仍保持着正常的功能(采用“50%规则”)；
※b．顶芽没有明显的损伤或腐烂，有一片正常的初生叶，如菜豆属；
※c．菜豆属的初生叶形状正常，大于正常大小的四分之一；
※d．具有三片初生叶而不是两片，如菜豆属(采用“50%规则”)。
※⑤芽鞘：
※a．芽鞘局部损伤；
※b．芽鞘从顶端开裂，但其裂缝长度不超过芽鞘的三分之一；
※c．受内外稃或果皮的阻挡，芽鞘轻度扭曲或形成环状；
※d．芽鞘内的绿叶，没有延伸到芽鞘顶端，但至少要达到芽鞘的一半。
3. 次生感染的幼苗
※由真菌或细菌感染引起，使幼苗主要构造发病和腐烂，但有证据表明病源不来自种子本身。
（二）不正常幼苗的鉴定标准
※不正常幼苗分为受损伤的幼苗、畸形或不匀称的幼苗和由初生感染的腐烂幼苗三类：
1. 受损伤的幼苗
※由机械处理、加热、干燥、冻害、化学处理、昆虫损害等外部因素引起，使幼苗构造残缺不全或受到严重损伤，以致不能均衡生长者。这类所产生的不正常幼苗类型主要有：
※子叶或幼苗中轴开裂并与其他幼苗构造分离；下胚轴、上胚轴或子叶横裂或纵裂；胚芽鞘损伤或顶部破裂；初生根开裂、残缺或缺失。
2. 畸形或不匀称的幼苗
※由于内部因素引起生理紊乱，幼苗生长细弱，或存在生理障碍，或主要构造畸形或不匀称者。这类所产生的不正常幼苗类型主要有：
※初生根停滞或细长；根负向地性生长；下胚轴、上胚轴或中胚轴粗短、环状、扭曲或螺旋形；子叶卷曲、变色或坏死；胚芽鞘短而畸形、开裂、环状、扭曲或螺旋形；缺失叶绿素（幼苗黄化或白化）；幼苗纤细；幼苗透明水肿状（玻璃体）。
3. 腐烂幼苗
※由初生感染(病源来自种子本身)引起，使幼苗主要构造发病和腐烂，并妨碍其正常生长者。
※在实际应用过程中，由于不正常幼苗只占少数，而且只要能鉴别不正常幼苗就行。
※凡幼苗带有下列其中一种或一种以上的缺陷则列为不正常幼苗。
（1）根
※①初生根 初生根残缺；短粗；停滞；缺失；破裂；从顶端开裂；缩缢；纤细；卷缩在种皮内；负向地性生长；水肿状；由初生感染所引起的腐烂。
※②种子根 种子根没有或仅有一条生长力弱的种子根。
（2）下胚轴、上胚轴或中胚轴
※下胚轴、上胚轴或中胚轴缩短而变粗；深度横裂或破裂；纵向裂缝(开裂)；缺失；缩缢；严重扭曲；过度弯曲；形成环状或螺旋形；纤细；水肿状（玻璃体）；由初生感染所引起的腐烂。
（3）子叶(采用“50%规则”)
※①除葱属外所有属的子叶缺陷 子叶肿胀卷曲；畸形；断裂或其他损伤；分离或缺失；变色；坏死；水肿状；由初生感染所引起的腐烂。
※②葱属子叶的特定缺陷 葱属子叶缩短而变粗；缩缢；过度弯曲；形成环状或螺旋形；无明显的“膝”；纤细。
（4）初生叶(采用“50%规则”)
※初生叶畸形；损伤；缺失；变色；坏死；由初生感染所引起的腐烂；虽形状正常，但小于正常叶片大小的四分之一。
（5）顶芽及周围组织
※顶芽及周围组织畸形；损伤；缺失；由初生感染所引起的腐烂。
（6）胚芽鞘和第一片叶(禾本科)
※①胚芽鞘 胚芽鞘畸形；损伤；缺失；顶端损伤或缺失；严重过度弯曲；形成环状或螺旋形；严重扭曲；裂缝长度超过从顶端量起的三分之一；基部开裂；纤细；由初生感染所引起的腐烂。
※②第一叶 第一叶延伸长度不到胚芽鞘的一半；缺失；撕裂或其他畸形。
（7）整个幼苗
※畸形；断裂；子叶比根先长出；两株幼苗连在一起；黄化或白化；纤细；水肿状；由初生感染所引起的腐烂。
※为便于全面理解其含义，图13-4至图13-10示意各种缺陷的不正常幼苗。
（三）幼苗鉴定指南
※ISTA于20##年发布第三版《幼苗鉴定手册》，其中较有参考价值之一是明确了幼苗鉴定指南，作为判定正常幼苗与不正常幼苗标准的补充。
三、幼苗鉴定按属分类细则
（一）幼苗鉴定按属分类
※由于各个种的不同属幼苗形态特征结构的差异和不同构造对鉴定正常幼苗的重要性，为了便于正常幼苗鉴定，ISTA幼苗鉴定手册将具有相似幼苗形态特征和发育特性的属归为一类。
其具体归类依据如下：
1、按植物种类分为A、B两类：
A、农业及园艺(如洋葱、水稻、小麦、玉米、油菜、菜豆、豌豆等)。
B、乔木及灌木(如松树和冬青等)
2、按子叶系统分类分为三类：
1、单子叶植物(如洋葱、小麦、玉米等)
2、双子叶植物(如油菜、菜豆、豌豆、西瓜、棉花等)。3、针叶植物(如松树等)
3、按发芽习性分类分为两类：
(1)子叶出土型发芽植物；(如洋葱、大豆、菜豆、甘蓝等)(2)子叶留土型发芽植物；(如小麦、玉米、水稻、豌豆等)
4、按茎轴伸长和幼梢生长特性分类分为四类：
(1)上胚轴不伸长种类(如油菜、西瓜)
(2)上胚轴伸长种类(如豌豆、大豆、菜豆等)
(3)幼梢不伸长，苗端被芽鞘包裹着种类(如水稻、小麦、玉米等)
(4)块茎状下胚轴种类(如仙客来等)
5、按根系发育特性及其在幼苗鉴定的重要性分类分为三类：
(1)必需具备初生根的种类(如甘蓝、洋葱等)
(2)可考虑发育良好次生根的种类(如水稻、玉米、棉花等)(3)具有相同种子根的种类(如小麦等)
※根据上述分类依据，就可按种、属编制正常幼苗的按属分组编码索引（见表13-5）。而根据各属分组幼苗鉴定索引就可把握该属幼苗鉴定的关键要素，从而更好地正确鉴定幼苗。
※例如小麦，属小麦属，幼苗鉴定的分类编码为A.1.2.3.3（ A-农业及园艺；1-单子叶植物；2-子叶留土型发芽植物；3-幼梢不伸长，苗端被芽鞘包裹着种类；3-具有相同种子根的种类），含义为农作物的单子叶植物，子叶留土发芽，幼苗胚轴不伸长，苗端被胚芽鞘包裹着。在幼苗鉴定时，考虑具有相同的种子根。若种子根有损伤，但至少有一条健壮的种子根，则为正常幼苗。
（二）农作物幼苗发育类型
※根据幼苗鉴定按属分组编码方法，任何种、属都可以划分到这种属的幼苗形态特征和发育特性的组中。下面分别介绍GB/T 3543.4－1995《农作物种子检验规程 发芽试验》所包括的农作物幼苗发育类型。
※1．单子叶植物
※GB/T 3543.4－1995《农作物种子检验规程 发芽试验》包括的单子叶植物分属幼苗鉴定归属于五个组，其鉴定细则列表13-6。
表13-6 单子叶植物分属幼苗鉴定细则
注：不正常幼苗评定标准指凡幼苗带有其中一种或一种以上的缺陷则列为不正常幼苗。
※例如：稻属 (如水稻)、玉米属 (如玉米)均属于A1．2．3．2组，为子叶留土型发芽的单子叶植物。幼苗胚轴不伸长，苗端被胚芽鞘包裹着，第一片营养叶生长。变态的子叶部分即盾片留在种子内与胚乳相连。根系统由初生根和次生根组成，在幼苗鉴定时，如初生根有缺陷，可考虑次生根的生长状况。
2．双子叶植物
※GB/T3543.4－1995《农作物种子检验规程 发芽试验》包括的双子叶植物分属幼苗鉴定归属于四个组，其鉴定细则列表13-7。
表13-7 双子叶植物分属幼苗鉴定细则
※例如：棉属（如棉花）、甜瓜属（如西瓜）均属于A2．1．1．2组，为子叶出土型发芽的双子叶植物。幼苗中轴由一条伸长的下胚轴和两片子叶组成，在试验期间上胚轴不伸长，子叶间的顶芽不明显。根系由具有根毛的初生根和次生根组成，在幼苗鉴定时，如初生根有缺陷，可考虑次生根的生长状况。
第七节 包衣种子发芽试验
※包衣种子的发芽试验可用不脱去包衣材料的净丸化(净包膜)种子和脱去包衣材料的净种子两种方法进行试验。
※如同净度分析一样，后者只在特殊情况下：应送验者要求或为了核实(或比较)丸化或包膜种子内的净种子发芽能力时才使用。后者与非包衣种子检验程序完全相同，在除去包衣材料时不应影响发芽率。
※不脱去包衣材料的发芽试验程序如下。
一、数取试样
※除委托检验外，包衣种子发芽试验的试样是从经净度分析后的净丸化(净包膜)种子中分取，先将其充分混合，随机数取400粒，分4个重复，每个重复100粒。
※种子带的发芽试验须在带上进行，不必从制带物质中取下种子。试验样品由随机取得的带片组成，重复4次，每重复至少含100粒种子。
二、置床培养
※发芽床、发芽温度、光照条件和特殊处理采用GB／T 3543．4规定。
※倘若发芽结果不能令人满意时，发芽床最好采用砂床，有时也可用土壤。或者丸化种子采用皱裥纸作发芽床，种子带必须采用纸间的发芽方法。
※供水情况依据包衣材料和种子种类而不同。如果包衣材料粘附在子叶上，可在计数时用水小心喷洗幼苗。
三、幼苗计数与鉴定
※试验时间可能比GB/T 3543.4所规定时间要长，因此延长试验时间是必要的。但发芽缓慢可能表明试验条件不适宜时，这时需要做一个脱去包衣材料的种子发芽试验作为对照。幼苗异常情况可能由于丸化或包膜材料所引起，当发生怀疑时用土壤进行重新试验。
※正常幼苗与不正常幼苗的鉴定标准仍按GB/T 3543.4规定进行。一颗丸粒或包膜粒，如果至少能产生送验者所叙述种的一株正常幼苗，即认为具有发芽能力，如果不是送验者所叙述的种，即使长成正常幼苗，也不能包括在发芽率内。
※复粒种子构造可能在丸化种子中发生，或者在一颗丸粒中发现一粒以上种子。在此种情况下，应把这些颗粒作为单粒种子试验。用至少产生一株正常幼苗的构造或丸粒百分率表示。
※对产生二株或二株以上的丸粒，要分别计算其颗粒并记录。
四、结果计算、表示与报告
※其结果以粒数的百分率表示。种子带发芽试验时，要测定种子带总长度(或面积)，记录正常幼苗总数，计算每米(或每平方米)的正常幼苗数，推算每米的正常幼苗数。
※结果报告按GB/T 3543.4的规定。
第十四章 生活力的四唑测定
※实际工作中如种子贸易时常需要在短时间内掌握种子批的生活力状况，如果种子处于休眠状态则难以通过发芽测定得到结果。
※种子生活力测定可以满足这一需要，四唑测定可以测定出休眠种子样品的生活力百分率。
※四唑测定方法于1942年由德国的G. Lakon教授发明，第2次世界大战期间传入美国。随着四唑测定技术的发展，ISTA(国际种子检验协会)于1950年成立四唑测定技术委员会，致力于种子四唑测定技术的发展。
※20##年出版《ISTA四唑测定工作手册》，列有120种农业和122种林业种、属的四唑测定方法。
第一节 概述
一、生活力概念
※种子生活力（seed viability）是种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。
二、种子生活力测定的意义
1. 可以测定休眠种子的生活力
2.快速预测种子发芽能力
※种子贸易中，常因时间紧迫，不可能采用正规的发芽试验来测定发芽力，这是因为发芽试验所需的时间更长。
三、四唑染色测定的原理
※在种子组织活细胞内脱氢酶的作用下，无色的氯化三苯基四氮唑，接收活种子代谢过程中呼吸链上的氢，在活细胞里变成还原态的红色、稳定、不扩散的三苯基甲月替(Triphenyl Formazam)。可根据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。
※种子有无生活力主要取决于胚和(或)胚乳(或配子体)坏死组织的部位和面积的大小，而不一定在于颜色的深浅。颜色的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织判别出来。根据以上理由和所用指示剂，把这种测定称为“局部解剖图形的四唑测定”(topographical tetrazolium test)。
※这就是说，是根据种子胚和活营养组织局部解剖染色部位及颜色状况，鉴定种子胚的死亡部分，查明种子死亡的原因。
四、四唑测定适用的范围
※收获后需马上播种的种子；
※具有深休眠的种子；
※发芽缓慢的种子；
※要求估测发芽潜力的种子。
※另外，也适用于测定发芽末期个别种子的生活力，特别是怀疑有休眠时；测定已萌发种子，或收获期间存在的不同类型和/或加工的损伤（热害、机械损伤或虫蛀等）种子；解决发芽试验中存在的问题，如不清楚不正常幼苗产生的原因或怀疑杀菌剂的处理效果等。
五、四唑测定方法的特点
※四唑测定是一种世界公认、广泛应用、实用方便、省时快速、结果可靠的种子生活力检验方法。具体地说具有以下几个特点：
※1.原理可靠，结果准确。
※如能正确使用四唑测定方法，四唑测定结果与发芽率误差一般不会超过3%～5%。
※2.不受休眠限制。
※3.方法简便、省时快速。
※4.成本低廉。
※四唑测定也有其缺陷：如对种子检验员经验和技能要求较高；结果不能提供休眠的程度；处理种子不会像发芽试验能反映药害情况。
第二节 试剂的配制和仪器设备
一、试剂的配制
1．四唑溶液
2．磷酸缓冲液
3．乳酸苯酚透明液
采用乳酸苯酚透明液，是使小粒豆类和牧草种子经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变为透明,以便透过这些部分清楚地观察其胚主要构造的染色情况。
二、仪器和设备
※四唑测定的主要仪器设备与发芽试验设备相同，可采用其设备：如电热恒温箱或发芽箱、冰箱。
※四唑测定需配备的小器具有：种子切割工具如解剖刀或刀片、小针、切割垫板等；种子预湿需要纸、毛巾、烧杯等器具；染色时，要准备有盖的不同规格的染色盘、棕色加液器、镊子、吸管等；观察器具如体视显微镜或放大镜；以及保护器具如手套、眼睛保护镜、废液处理容器等。
第三节 四唑测定程序
一、试验样品的来源数取
※试验样品来源必须是净种子。净种子可以从净度分析后的净种子中随机数取，也可以从送验样品中直接随机数取。一般随机数取100粒种子，2～4个重复或少于100粒的若干副重复。
※如果是测定发芽末期休眠种子的生活力，则可单用试验末期的休眠种子。
※委托检验可以直接从经充分混合的种子样品中随机数取种子。
二、种子预处理
※在正式测定前，对所测种子样品需经过预处理（预措预湿），其主要目的是使种子加快和充分吸湿，软化种皮，方便样品准备和促进活组织酶系统的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确性。
※预措---是指在种子预湿前除去种子的外部附属物和在种子非要害部位弄破种皮，如水稻种子需脱去内外稃壳，豆科硬实种子刺破种皮等，但须注意，预措不能损伤种子内部胚的主要构造。绝大多数种子不须进行预措处理，但有一些种子在预湿前要进行预措处理。
※预湿是四唑染色测定的必要步骤。预湿方法目前常用的有以下两种方法：
1．缓慢润湿
※缓慢润湿是按种子发芽试验所采用方法，将种子放在纸床上或纸巾间，让其缓慢吸湿。该法适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子。
※缓慢润湿可采用下面两种方法：
※①纸卷或纸间预湿
※②纸床上预湿
2．水中浸渍
※水中浸渍是将种子完全浸入水中，种子吸水快、均匀，并可缩短预湿时间。该法适用于种子直接浸入水中不会造成组织破裂损伤，并不会影响鉴定结果的种子种类，包括水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦草、黑麦、玉米等，详见表14-l。浸种温度一般采用20～30℃或30℃水温。
三、染色前的样品准备
※为了使四唑溶液快速和充分渗入种子的全部活组织，加快染色反应和正确鉴定胚的主要构造，大多数种子在染色前必须采用适当的方法使胚的主要构造和(或)活的营养组织暴露出来。
1．不须样品准备
※种皮渗水性良好的豆类种子，在四唑溶液里染色时，就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在染色后剥去种皮就可正确鉴定，这类种子不须样品准备。
2．沿胚纵切3．近胚纵切4．上半粒纵切5．斜切种子6．剥去种皮7．横切胚轴和盾片8．平切果种皮和胚乳，暴露出胚的构造9．穿刺或切开胚乳10．切去种子基端11．横切胚乳
1．禾谷类和禾本科牧草种子通过胚和约在胚乳四分之三处纵切。
2．燕麦属(Avena)和禾本科牧草种子靠近胚部横切。
3．禾本科牧草种子通过胚乳末端部分横切和纵切。
4．禾本科牧草种子刺穿胚乳。
5．通过子叶末端一半纵切，如莴苣属(Lactuca)和菊科(Asteraceae)中的其他属。
6．纵切面表明似上述第5种方式进行纵切时的解剖刀部位。
7。沿胚的旁边纵切[伞形科(Apiaceae)中的种和其他具有直立胚的种]
8．针叶树种子沿胚旁边纵切。
9．在两端横切，打开胚腔，并切去小部分胚乳(配子体组织)o
四、四唑染色
※四唑溶液必须完全淹没种子，溶液不能直接露光，因为光线可能使四唑盐类还原而降低其浓度，影响染色效果。
※按表14-1（GB/T 3543.7-1995表1）的要求，将经过样品准备或不须准备的规定数量种子分别放入四唑溶液里染色。小粒种子可用直径6cm培养皿，大、中粒种子可用9cm培养皿或更大的容器，特别细小的种子可包在滤纸内，分别放入容器里。然后加入适宜浓度的四唑溶液，移置一定温度的恒温箱内进行染色反应。
五、鉴定前处理
※为了确保鉴定结果的正确性，还应将已染色的种子样品，加以适当的处理，再进一步使胚的主要构造和活的营养组织明显地暴露出来，以便观察鉴定。
1．不须处理，直接观察
※适用于染色前已进行样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品。因为这些种子胚的主要构造已暴露在外面，所以不须附加处理，就可直接观察鉴定。
2．轻压出胚，观察鉴定
3．扯开营养组织，暴露出胚
4．切去一层营养组织，暴露出胚和活营养组织
5．沿胚中轴纵切，暴露胚的构造
6．沿种子中线纵切，暴露出胚和活营养组织
7．剥去半透明的种皮或种子组织，暴露出胚
8．切去切面碎片或掰开子叶，暴露出胚
9．剥去种皮和残余营养组织，暴露出胚
10．乳酸苯酚透明液的应用
※加入2—4滴乳酸苯酚透明液，适当摇晃，使其与种子良好接触，38℃恒温箱保持30～60min，经清水漂洗或直接观察。
六、观察鉴定
※一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力种子。
※凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染色部分已超过二分之一，或超过容许范围，以及组织软化的，完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软化腐烂或异常、虫蛀、损伤的均为无生活力种子。
图14-2 玉米种子四唑染色图谱
1. 有生活力——胚全染成深红色。2.有生活力——仅盾片两端少部不染色。3.有生活力---仅盾片先端及胚芽鞘先端及少部不染色4.有生活力——胚芽鞘先端不染色.5.有生活力—胚芽鞘先端及胚根顶端2／3以下不染色，种子根区染色6.无生活力——胚根大部不染色，已波及种子根区。7.无生活力——胚芽全不染色。8.无生活力——胚轴不染色。9.无生活力—盾片与胚轴连接处不染色。10.无生活力——盾片两端不染色部份已超过1／2。11.无生活力——盾片1／2以上不染色。12.无生活力——胚全不染色。
图14-3 水稻种子四唑染色图谱
1. 有生活力——胚全染成深红色（不染部分属胚芽鞘和盾片间隙）。2.有生活力——盾片先端染色稍浅。3.有生活力---盾片先端及胚芽鞘先端不染色4.无生活力——胚根全不染色.5.无生活力—胚芽先端、胚芽鞘及盾片先端染色较浅。6.有生活力——胚全染成红色。7.有生活力——盾片全部染色，胚根胚芽鞘部分染色较浅。8.无生活力—盾片全不染色。9.无生活力——胚大部分染色较浅。10.无生活力——胚全不染色。
图14-4 棉花种子四唑染色图谱
1. 有生活力——染色后将子叶分开的胚可见两片子叶及怔根均染成红色。2.有生活力——胚全染成深红色 3.无生活力——胚根中段不染色。4.无生活力——子叶关键部位不染色。5.无生活力——子叶基部不染色。6.无生活力——胚根中部很长一段不染色。7.无生活力——胚根先端不染色，子叶内部大部染色很浅。8.无生活力——子叶大部不染色。9.无生活力——胚全不染色。
图14-5 番茄种子四唑染色图谱
1. 有生活力——胚全染色。2.无生活力——胚根基部及子叶先端不染色或染色很淡。3.无生活力一—子叶基部不染色。4.无生活力——子叶大部染色很淡。5.无生活力——子叶全不染色。6.无生活力——胚根先端明显不染色。7.无生活力——胚的中段，包括胚轴及与之相连的胚根及子叶均不染色8.无生活力——胚全不染色。
图14-6 辣椒种子四唑染色图谱
1.有发芽力——胚全染色。2.有发芽力——片子叶顶端约1／2不染色，另一片全染色。3.无发芽力—胚根先端不染色，子叶中部有一小段染色很浅。4.无发芽力——子叶中段不染色。5.无发芽力——子叶全不染色。6.无发芽力——子叶基部—端不染色。7.无发芽力——胚多处不染色。8.无发芽力——胚全不染色。
图14-7 油菜种子四唑染色图谱
1、2.有生活力——胚全染成深红色。3.有生活力---子叶顶端有小于1/3不染色4.无生活力——胚根先端及侧面有大于直径1/4的不染色.5.无生活力—胚根基部不染色，子叶极小部分不染色6.无生活力——胚根一侧约1/2不染色。7.无生活力——胚根大部分不染色。8.无生活力——子叶与胚轴相连处不染色。9.有生活力—外方一枚子叶非关键部位部分不染色。10.无生活力——外方一枚子叶染色很浅。11.无生活力——仅子叶的一部分染成浅红色，其余全部不染色。12.无生活力——胚全不染色。
第十五章 活力测定
种子活力(seed vigor)是种子质量的重要指标之一,也是反映种用价值的主要组成部分,与种子田间出苗质量密切相关。活力的测定经过几十年的研究，已经取得了重大进展。在美国和欧洲，活力测定应用已经很普遍，许多种子公司把活力测定作为常规的检测项目。
第一节 概述
一、种子活力的概念和定义 种子活力不像种子发芽率那样是一个单一的测定特性，而是描述种子出苗不同方面（包括田间和贮藏期间）的综合特性。
20##年出版的《国际种子检验规程》将活力定义为：
“种子活力是指在广泛的环境条件下，决定可接受发芽率的种子批的活性和性能那些特性的综合表现”。
并作了进一步的阐述，种子活力不是一种简单的测定概念，而是一种能表达如下有关种子批性能多种特性的综合概念：（1）种子发芽和幼苗生长速率和整齐度；
（2）种子在不利环境条件下的出苗能力；
（3）贮藏后，特别是能保持发芽力的性能。
高活力种子批即使在不适宜的环境条件下，仍具有良好性能的潜力。
二、种子活力的重要意义
1．高活力种子的生产优越性：种子活力是种子重要的品质，高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力。(1)提高田间出苗率。(2)抵御不良环境条件。(3)增强对病虫、杂草的竞争能力。 (4)抗寒力强，适于早播。(5)节约播种费用。(6)增加作物产量。(7)提高种子耐藏性。
可见，高活力种子对农业生产具有十分重要的意义。
三、活力、生活力和发芽力的区别及关系
1．种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力，通常用供检样品中活种子数占样品总数的百分率表示。
２．种子发芽力是指种子在适宜条什下（检验室控制条件下）长成正常植株的能力，通常用供检样品中长成正常幼苗数占样品总数的百分率，即发芽率表示。
《国际种子检验规程》指出，在下列6种情况下，如果鉴定正确，生活力测定和发芽率测定的结果基本是一致：
①无休眠、无硬实或通过适宜的预处理破除了休眠和硬实；
②没有感染或已经过适宜的清洁处理；
③在加工时未受到不利条件或贮藏期间未用有害化学药品处理；
④尚未发生萌芽；
⑤在正常或延长的发芽试验中未发生劣变；
⑥发芽试验是在适宜的条件下进行的。
３．种子活力简单地说就是指高发芽率种子批间在田间表现的差异。
由此可见，种子活力是比发芽率更敏感的指标，在高发芽率的种子批中，仍然表现出活力的差异。通常高发芽率的种子具有较高活力，但两者不存在正相关。
关于活力和发芽之间的关系,Isely已于1957年以图解形式表示（见图15-1）。
第二节 种子活力测定方法分类和要求
一、活力测定方法的分类
种子活力测定方法的种类多达数十种。其分类的方法归纳起来不外乎直接法和间接法两类。
直接法是在检验室条件下模拟田间不良条件测定田间出苗率的方法，如低温处理是模拟早春播种期的低温条件；砖砂（砾）试验是模拟田间板结土壤或粘土地区的条件。
间接法是在检验室内测定与田间出苗率（活力）相关的种子特性的方法，如测定某些生理生化指标（酶的活性、呼吸强度等）及测定生化劣变处理后的发芽率（加速老化试验、人工劣变试验等）。
现将ISTA和AOSA推荐和建议的活力测定方法及种类简介如下：
1．ISTA活力测定方法（《活力测定力法手册》，1995版）
第一类是推荐种子活力测定方法，也是目前《国际种子检验规程》已经列入的方法，包括两种方法：
电导率测定（conductivity test）、
加速老化测定（accelerated ageing test）。这两种推荐方法已基本上标准化，将在下面作详细的介绍。
第二类是建议的种子活力测定方法，包括七种不同类型的方法：
①冷冻测定（cold test）；
②低温发芽测定（cool germination test）；
③人工控制劣变试验（controlled deterioration test）；
④复合逆境活力测定（complex stressing vigor test）；
⑤希尔特纳试验（hiltner test）；
⑥幼苗生长测定（seedling growth test）包括幼苗测量和幼苗评定，幼苗测量包括幼苗生长测定和幼苗生长速率测定，幼苗评定包括卷纸法和砂法；
⑦四唑测定（tetrazolium test）包括剖面四唑法和糊粉层四唑测定两种方法。
2．AOSA活力测定方法（《活力测定手册》）
AOSA于1983年颁发了《活力测定手册》，该手册也包括两类的方法。
第一类是广泛应用的方法：①幼苗生长和评定试验（幼苗活力分级、幼苗生长速率测定发芽末期幼苗长度和干重）；②逆境试验（包括加速老化试验、低温试验、冷发芽试验）；③生化试验（包括四唑法和电导率法）。
第二类是推荐应用的方法：①幼苗生长和评定试验；②逆境试验（包括砖砂试验、渗透逆境试验即高渗试验）；③生化测定（包括呼吸测定、谷氨酸脱羧酶（GADA）活性测定、ATP含量测定）。
AOSA 所列方法较多，其中有六种测定方法与ISTA规定的方法基本相同。
二、选用活力测定方法的原则和要求
1．选用原则
根据当地土壤气候条件选用适宜的方法，如低温试验适合早春播种季节低温气候条件，不适合于早春温暖地区，再如砖砂试验适用于粘土地区或雨后土壤板结情况，不适用于土壤较为疏松地区，欧洲土壤粘重应用砖砂试验较多，而美国则很少应用，仅作为推荐方法。
根据作物的特性选用适宜的方法。如低温试验和冷发芽法适用发芽期间耐寒性较差的喜温作物，如玉米、大豆等，不适用于耐寒性较强的作物，如大麦、小麦、油菜等。又如电导率测定是豌豆种子的典型测定方法，其测定结果与田间出苗率高度相关，但对其他作物种子并非适合，其测定结果与田间出苗相关性较差。
2．选用要求
①节约费用，仪器设备不能太昂贵；
②简单易行，测定技术不太复杂，易于推广；
③快速省时，短期内可获得测定结果；
④结果准确，能真实反映一批种子的活力水平，且与田间出苗率有良好相关；
⑤重演性好，在同一检验室不同检验人员或在不同检验室能获得比较一致的结果。
三、活力测定方法的基本要求
1．试样种子
试验样品来源必须是净种子。净种子可以从净度分析后的净种子中随机数取，也可以从送验样品中直接随机数取。
除委托检验外，所需种子数和重复必须随机从种子批的有代表性样品的净种子部分中数取。
２．方法和试验条件
活力测定方法各不相同，具体的方法和使用仪器及试验条件将在本章以后各节中加以说明。
３．对照样品
活力测定需要比标准发芽试验更加严格的试验条件控制，因此，种子活力测定的检验室需要制备对照样品。
设置对照样品的目的是为活力测定结果提供一致性的内在质量控制。对照样品的结果差异反映了试验条件（如温度、种子水分或其他因素）的微小变异，而会导致明显影响结果的可靠性。
4．结果计算与表示
将在本章以后各具体方法中节中加以叙述给出其详细程序。
5．结果报告
填报采用本章第三节和第四节规定的程序，将活力测定结果，填报在检验报告“其他测定”栏内。同时结果还须附有检测方法的说明，包括必要时测定方法及条件包括时间、温度和种子水分等信息。
第三节 加速老化试验
一、原理
加速老化试验(accelerated ageing test，以下简称AA测定)是根据高温(40～45℃)和高湿(100％相对湿度)能导致种子快速劣变这一原理进行测定。
高活力种子能忍受逆境条件处理，劣变较慢；而低活力种子劣变较快，长成较多的不正常幼苗或者完全死亡。
AA测定最早是由Delouehe等(1973)创造的用来预测许多种的种子寿命。经过多年的发展，目前AA测定主要用于两方面，一是预测田间出苗率二是预测耐藏性
二、适用范围与局限性
《国际种子检验规程》所规范的AA测定法适用于大豆种子；
ISTA手册指出该法也适用于许多其他种，详见表15-2所列的种。AA测定结果也是可以控制的。AOSA和ISTA用大豆种子核准试验表明在试验室间有很大的一致性，并证实AA发芽试验与田间出苗的关系。现在也有足够证据证实用该试验能取得重演性结果。因此，AOSA现在认为作为大豆试验的方法已经标准化，可以推荐。但是必须按本节所规定的程序和仪器进行操作，在温度控制、样品大小或老化时间的小量改动会引起最后水分和(或)发芽率的变化。
三、仪器和药品
１．老化外箱：推荐应用水套培养箱，保持恒温(41土0.3)℃。如果没有水套培养箱，其他有加水的加热培养箱也可。使用这些培养箱，水应在外箱内，以防凝结。水掉在内箱盒上，会在盖内产生凝结，提高种子水分，降低发芽率，增加发霉。因此，当外箱有大量凝结水时，当心保护内箱在老化期间的小水点积累。外箱通常不需要很准确的温度控制，需要附加控制保持温度均匀。
２．老化内箱：老化内箱为带盖的塑料盒，大小为11.0cm×11.0cm ×3.5cm，内有一个网架盘10.0cm×l0.0cm×0．3cm(网孔为14×18)。老化内箱可以购买，也可以自制（见图15-3）。注意盖不应密封（见图15-3）。
３．天平：感量为0.001g。
４．水：去离子水或蒸馏水。
５．带刻度的容量杯：刻度从0至100mL，从标准的容量器或有50mL刻度的容器准确量取40mL水。
６．铝盒(供种子水分测定)。
７．发芽试验设备。
四、程序
1．预备试验．
（１）检查老化外箱
※老化外箱的温度必须经过国家标准计量院的检定或类似的温度计。
（２）检查温度
※收集按规定的程序／系统进行操作的老化外箱的温度和其均匀度的记录数据，如果记录显示能达到表15-2所规定的温度（对于大豆种子，所有水平应达到4l±0.3℃)下才能进行AA测定。
（３）保证老化内箱的清洁度
※为了防止菌类污染，使用过的老化内箱、盖和网架需经过热消毒或用15％次氯酸钠溶液洗净并烘干，才可进行AA测定。
２．测定每一种子批的程序
（１）检查种子水分
※如果不知道测定种子批的水分，应采用烘箱法测定种子批的水分。对于水分低于10％或高于14％的种子批，应在AA测定前将其水分调节至10％～14％。
※记录种子水分，决定是否必须提高种子水分或降低种子水分至规定范围。
（２）准备老化内箱
※把40mL去离子水或蒸馏水放入老化内箱，然后放入网架，确信水不渗到网架和后加的种子上。
※从净种子中称取42g(至少含有200粒种子)种子，称重后放在网架上，摊成一层。
※老化的种子最好不要经过处理，然而，该作物种子是以杀菌剂处理销售的，可以使用处理种子。每次外箱用于AA测定，应包括一个对照样品。保证每一内箱有盖(不要封口)。注意盖不应密封。
（３）使用老化外箱
※内箱排成一排放在架上，同时放入外箱内。为了使温度均匀一致，外箱内的两个内箱之间间隔大约为2.5cm。
※记录内箱放人外箱的时间。准确监控老化外箱的温度在表15-2的范围和时间内，如大豆种子在(41±0.3)℃温度保持72h。
※在老化规定期间，不能打开外箱的门。如果这时已经打开门，应从箱中取出种子重新进行测定。
（4）发芽试验
※经72h老化时间后，从外箱取出内箱，记录这时的时间。取出一小时内用50粒四个重复进行标准发芽试验。
※在同一天内如果有许多批种子进行老化试验，样品应进行分类，在两个老化外箱的试验应间隔1h，以便有时间在老化后进行置床发芽。大豆种子发芽的条件已在GB／T 3543.4中给出。
（5）检查老化后对照样品的水分
※在老化结束时进行标准发芽前，从内箱中取出对照样品的一个小样品(10～20粒)，马上称重，用烘箱法测定种子水分(以鲜重为基础)。
※记录对照样品种子水分，如果种子水分低于或高于表15-2所规定的值(对于大豆，种子水分应在27％～30％)，则试验结果不准确，应重作试验。
（6）结果计算与表示
※用四次50粒重复的平均结果表示人工老化发芽结果，以百分率表示。
（7）结果说明解释
※AA测定并不提供一个绝对的活力范围，只是通过一段时间的高温高湿逆境后进行发芽试验的结果。
※该结果与老化前同一种子批的发芽试验结果比较，如果AA结果类同于标准发芽试验结果为高活力，低于标准发芽试验结果为中至低活力。这样，可用该结果来排列种子批活力，来判定贮藏潜力或每一种子批的播种潜力。
第四节 电导率测定
※高活力种子细胞膜完整性好，浸入水中后渗出的可溶性物质或电解质少，浸泡液的电导率低。电导率与田间出苗率成显著的负相关，借此可用电导率的高低判别种子活力的高低。
※大粒豆类种子的电导率结果提供比标准发芽与田间出苗率更强的相关性。
一、原理
细胞膜在种子生理成熟前的种子发育中发生了结构变化，种子劣变发生于成熟前和发芽前的吸胀。劣变生化变化和生理紊乱所引起的细胞膜完整性变化是造成种子活力的最主要差异。在早期吸胀时，细胞膜的恢复和修补可能影响种子的渗漏率。种子重组恢复细胞膜的速度越快，渗漏液越少。高活力种子能迅速修复细胞膜能力，而低活力种子较差，所以，高活力种子所测得的电导率比低活力种子低。低活力种子批的渗漏会造成二次感染，种子渗漏的营养液加速土壤微生物活动和二次感染。种子中渗出的碳水化合物的数量也与细菌生长呈正相关。
二、适用范围与局限性
※《国际种子检验规程》所规范的电导率测定适用于豌豆种子；
※ISTA活力手册指出该法也适用于许多其他种，如大粒豆科种子（特别是大豆、绿豆等）、棉花、玉米、番茄、洋葱等种子。AOSA 和ISTA 活力测定委员会认为，菜豆和大豆的电导率测定结果具有重演性，与田间出苗率有较大的相关性，该测定已被种子产业用来评定菜豆种子出售前的出苗率。
※已在欧洲、澳大利亚、新西兰和北美已得到广泛地使用。电导率测定作为一个快速、客观的活力测定方法，特别易用于大多数种子检验室检测，因为该项目的仪器投入较少、人员培训简单。
※有几种因素影响电导率结果，
※第一种因素是大粒豆类种皮的物理损伤导致水分快速吸收，造成机械损伤和高水平的电解质渗漏，因此，某些研究者建议除去物理损伤种子。然而机械损伤种子的肉眼观察是主观的、不准确的，这些种子结果的例外会导致种子活力的过高估计。只能按照ISTA 规定从样品中扦取净种子，这样才能提供不偏样品供检验。
※第二种因素是种子大小，这涉及到在测定前通过称重而消失，并将结果表示为µS cm-1 g-1。
※第三种因素是原始种子水分，在测定前测定种子水分，调节种子水分不在10%～14%的种子批，可以消除这个问题。
※第四种是处理种子的影响，用大豆种子的研究表明，并不支持从处理后的种子去除杀菌剂，但是其他种子处理对电导率的影响并不知道，如果可能，应测定未处理的种子。
三、仪器和药品
1.电导仪
※可用直流电或交流电直接读数的电导仪，电极常数必须达到1.0（电极常数是指电极板之间的有效距离与极板的面积之比）。有关具体品牌、型号的电导仪可向ISTA秘书处咨询。
2.水 最好使用去离子水，也可使用蒸馏水。凡使用的水必须进行电导率测定。在20℃下，去离子水电导率不超过2μS cm－1；蒸馏水电导率不超过5μS cm－1。使用前水应保持在（20±1）℃。
3.烧杯或容器 为了保证有适宜的水浸没种子和电极，烧杯和容器的容量为500mL，基部宽80mm±5mm。容器使用前必须冲洗干净，并用去离子水或蒸馏水冲洗两次。
4.发芽箱、培养箱或发芽室 满足保持（20±1）℃的恒温。
5.烘箱 满足温度达到130℃或者103℃。
6.天平 感量达到0.01g。
7.铝盒（供种子水分测定用）。
四、程序
1.预备试验
（1）校正电极
（2）核查对照种子批的电导率
（3）检查仪器清洁度
（4）检查温度
2.测定每一种子批的程序
（1）检查种子水分
v 如果不知道测定种子批的水分，应采用烘箱法测定种子批的水分。对于水分低于10%或高于14%的种子批，应在浸种前将其水分调至10%～14%。
v（2）准备烧杯
v准确量取250mL去离子水或蒸馏水，放入500mL的烧杯中。每种子批测定4个烧杯。含水的所有烧杯应用铝箔或薄膜盖子盖好，以防止污染。在盛放种子前，先在20℃下平衡24h。为了控制水的质量，每次测定准备两个只含去离子水或蒸馏水的对照杯。
v（3）准备试样
v随机从种子批净种子部分数取每个各为50粒的四个次级样品，称重至0.01g。
v（4）浸种
v已称重的试样放入已盛有250mL去离子水的500mL、先粘有标鉴的容器中。轻轻摇晃容器，确保所有种子完全浸没。所有容器用铝箔或薄膜盖盖好，在（20±1) ℃放置24h。在同一时间内测定的烧杯的数量不能太多，不能超过电导率评定的数目，通常为10～12个容器，一批测定一般不超过15min。
v（5）准备电导仪
v试验前先启动电导仪至少15min。每次测定同时用去离子水或蒸馏水填满容器杯400～600mL 冲洗电极，作为冲洗水，去离子水电导率不应超过2μScm－1或蒸馏水不超过5μScm－1。
v(6）测定溶液电导率
v24h（±15min）的浸种结束后，应马上测定溶液的电导率。盛有种子的烧杯应轻微摇晃10～15s，移去铝箱或薄膜盖，电极插入不要过滤的溶液，注意不要把电极放在种子上。测定几次直到获得一个稳定值。测定一个试样重复后，用去离子水或蒸馏水冲洗电极两次，用滤纸吸干，再测定下一个试样重复。如果在测定期间观察到硬实，测定电导率后应将其除去，记数，干燥表面，称量，并从50 粒种子样品重量中减去其重量。
v（7）扣除试验用水的电导率
v在（20±1) ℃测定对照杯的去离子水或蒸馏水的电导率，比较该数与日常的水源记录（如果读数高于日常水源读数，表明电极清洁度有问题，应重新清洗电极，重新测定另一对照杯）。每一重复应从上述容器的测定值中减去对照杯中的测定值（烧杯的背景值）。
v处理种子的送验样品可能已经杀菌剂处理。目前没有证据表明种子杀菌剂处理会影响电导率结果，但是没有对所有的商用种子处理评定过。但是，不同纯度的商用杀菌剂中的某些含有添加剂会严重改变电导结果。所以，对于经过杀菌剂处理的种子应特别小心，特别是使用新的杀菌剂。
v（8）结果计算与表示
v根据下列公式计算每一重复的种子重量的每克电导率：
4次重复间平均值为种子批的结果。
四次重复间容许差距为5μS cm－1g－1（最低和最高的差），如超过，应重做4次重复。
v（9）结果说明解释
v根据电导率测定结果，即用活力水平对种子批进行排列。英国已在豌豆上应用多年，总结出表15-3的经验。
第五节 种子活力的其他测定方法
v一、幼苗生长特性测定
v幼苗生长特性测定主要包括幼苗生长测定、幼苗评定测定、种子发芽速率、发芽指数和活力指数测定等方法。
v这类测定方法是根据高活力种子幼苗生长快、幼苗健壮、生长正常、幼苗株大和重量较重等生长特性，而低活力种子则相反，借此来评定种子活力水平的差异。
v1.幼苗生长测定
v幼苗生长测定方法适用于具有直立胚芽和胚根的禾谷类和蔬菜类作物种子。其测定方法是取试样4份，各25粒。各取发芽纸3张(30cm×45cm)，取其中1张画线，先在纸长轴中心画一条横线作为中心线，距顶端15cm，并在其上、下每隔1cm画平行线。在中心线上平均间隔画25个点，在每点上放一粒种子，胚根端朝向纸卷底部，再盖两层湿润发芽纸，纸的基部向上折叠2cm，将纸松卷成4cm直径的筒状，用橡皮筋扎好，将纸卷竖放在容器内，上用塑料袋覆盖，置于黑暗恒温箱内培养7d，温度为正常发芽所规定的温度，然后统计苗长；计算每对平行线之间的胚芽尖端的数目；按下列公式求出幼苗平均长度。
式中：L为胚芽平均长度(cm)；
n为每对平行线之间的胚芽尖端数；
x为每对平行线之间中点至中心线之间的距离(cm)；
N为种子试样粒数。
发芽试验中不正常幼苗不统计长度。
直根作物种子可用直立玻板发芽法测定其幼根长度：各取滤纸2张，其中1张划一条中线，用水湿润贴在玻板上。将25粒种子等距排列在中心线上，将另一张滤纸湿润后盖上，将玻板以70°角直立置于水盘内，放在25℃黑暗下培养3d后测量根的长度，计算平均值。据报道莴苣田间出苗率与莴苣种子发芽3d的根长密切相关。
※2.幼苗评定试验
※幼苗评定试验(seedling evaluation test)适用于大粒豆类种子。这些种子不能用幼苗长度表示活力，因其细弱苗可达相当的长度，可采用标准发芽方法，幼苗评定时分成不同等级。例如，豌豆种子试验方法如下：取试样4份，各50粒。将1～2mm的粗砂清洗消毒后加水，使保持最大持水力约15％(W/W)，再放入4个容积为15cm×20cm×10cm的聚乙烯盒中，移于生长箱或培养箱中，于20℃、相对湿度95％-98％的条件下，光照12h、以光强度120001x培养，经6d后取出幼苗，洗涤干净，进行幼苗评定，先将种子分成发芽和不发芽两类，再将幼苗分成3级：
※(1)健壮幼苗 胚芽强壮、深绿色。初生根强壮或初生根少而有大量次生根。
※(2)细弱幼苗 胚芽短或细长，初生根少或较弱，但属正常幼苗。
※(3)不正常幼苗 根或芽残缺或根芽破裂，苗色褪绿等。第一级为高活力种子，第二级为低活力而具有发芽力的种子，将第一、二级相加即为种子发芽率。
※3.发芽速率测定
※发芽速率测定(germination rate test)是一种最古老和最简单的方法，适用于各种作物的活力测定。其方法是采用标准发芽试验，每日记载正常发芽种子数(牧草、树木等种子发芽缓慢，可隔日或隔数日记载)，然后按公式计算各种与发芽速度有关的指标。 (1)初期发芽率测定： 许多作物种子如小麦、大豆、玉米等，采用计算3d发芽率。也可采用计算发芽势或初次计算发芽率。
※(2)发芽达90％所需天数或达50％所需天数测定： 达50％所需天数测定可适用于发芽率较低的种子样品。
※(3)发芽指数测定：
式中：Dt为相应的发芽天数，Gt为与Dt相对应的不同时间（t天）的发芽数。∑为总和。
测定结果GI值与活力成正相关关系。
※(4)活力指数测定
式中：S为一定时期内幼苗长度(cm)或幼苗重量(g)，GI为发芽指数。
※(5)简易活力指数测定：
※此法适用于发芽快速的作物种子，如油菜、黄麻等。
式中：G为发芽率，S为幼苗长度(cm)或重量(g)。
(6)平均发芽天数（MGT）的测定
式中：G，Dt与发芽指数公式中相同。
※(7)相对发芽率测定 此法适用于发芽缓慢的树木或牧草种子。先计算峰值(PV)，然后计算平均发芽率(MDG)，最后计算发芽值（GV）
※幼苗生长和幼苗评定试验以及发芽速度的测定，均采用标准发芽试验，必须严格控制发芽温度、湿度和光照等条件，否则容易产生误差，同时测定人员必须具有评定幼苗的经验，才能获得准确结果。
二、抗冷测定
※抗冷测定(cold test)适用于春播喜温作物种子，如玉米、棉花、大豆、豌豆等。而秋播作物种子如大麦、小麦、油菜等种子，在发芽时具有忍耐低温的能力，故不宜应用此法测定活力。抗冷测定通常采用土壤卷法和土壤盒法，是将种子置于低温和潮湿的土壤中，经一定时间处理后移至适宜温度处生长，模拟早春田间逆境条件，观察和评定种子发芽成苗的能力。
1.土壤卷法
※取面积为30cm×60cm的发芽纸3张，各取种子50粒，4次重复。每一重复的种子排放在双层的、经充分吸湿并在10℃下预冷的纸巾上，种子在距纸巾顶边6cm和12cm处排成两行，每行25粒种子，然后覆盖土壤(从所需测定作物的地里取土)，保证所有种子直接与土壤接触。再用一张吸湿的发芽纸覆盖在上面，并将播有种子和土壤的发芽纸松卷成筒状，竖放在内有金属线分隔器的塑料桶或其他容器内。保证纸巾卷互相不接触。在塑料桶或容器顶部套盖上塑料袋防止水分的散失，将容器置于10℃(±0.5)的低温黑暗下处理7d，再移至25℃的黑暗条件下生长5d，按照标准发芽试验的标准评价幼苗，也可以将幼苗按强壮、细弱等进行分类。
2．土壤盒法
※各取玉米种子或大豆种子50粒，重复4次，播于装有3～4cm深的土壤盒内，然后盖土2cm，在10℃的低温下处理7d后，移入适宜温度下培养。玉米、水稻于30℃条件下经3d；大豆、豌豆于25℃条件下经4d；计算发芽率，凡正常幼苗作为高活力种子计算。此法手续简单，但所占空间较大。
三、低温发芽试验
※低温发芽试验(cool germination test)主要适用于棉花，也可用于高粱、黄瓜和水稻等种子。棉花早春播种常遇低温，会引起胚根损伤，下胚轴生长速率降低，棉花发芽最低温度一般为15℃。本法采用18℃低温模拟田间低温条件，其试验方法与标准发芽试验基本相同。种子置砂床后于18℃、黑暗条件下发芽，培养6d(硫酸去绒)或7d（未去短绒)，检查幼苗生长，凡苗高达4cm或以上的即为高活力种子。
※低温发芽试验法也可用纸巾卷发芽，用30cm×45cm的湿润发芽纸一张，置放50粒种子(类似于纸间发芽)，上盖一张湿润的发芽纸，将两层纸松卷成筒状，筒直径约为4cm，用橡皮筋扎住筒两端，斜放在桶或盒内，容器上顶留有10cm的空间，用塑料袋套住容器，用橡皮筋扎紧，将容器置于18℃黑暗条件下处理7d，到时间后将种子分成正常幼苗和不正常幼苗，计算正常幼苗是从根尖到子叶着生点的距离，凡达到4cm或以上的作为高活力种子。
四、控制劣变测定
五、复合逆境测定
※复合逆境测定是将种子进行一种以上的逆境胁迫处理，然后转入适宜条件下进行发芽。
※此类方法评定活力的指标基于一种以上的活力测定原理，因而能更准确的反映种子活力水平，试验结果与田间出苗率相关极显著，且重演性较好。
※目前，此法主要用于玉米、小麦种子，如将加速老化处理的种子再进行低温处理，然后进行适温发芽，统计正常幼苗（%），即加速老化试验与低温处理试验相结合测定种子活力。玉米种子的饱和抗冷测定，是将种子置于水分饱和的土壤床中进行低温处理试验，属于冷浸试验和低温处理试验二种原理相结合的复合逆境测定。
六、希尔特纳试验
七、解剖图形的四唑测定
八、糊粉层四唑测定
九、TTCH含量测定
十、ATP含量测定
第十六章 品种真实性及品种纯度的室内测定
※品种真实性（Cultivar genuineness）和品种纯度（Varietal purity）是构成种子质量的两个重要指标，是种子质量评价的重要依据。这两个指标都与品种的遗传基础有关，因此都属于品种的遗传品质。
第一节 品种纯度室内测定概述
※一、品种纯度的含义及意义
※品种纯度检验应包括两方面内容，即品种真实性和品种纯度。
※品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与文件描述（description）是否相符。如果品种真实性有问题，品种纯度检验就毫无意义了。
※品种纯度是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、穗数）占供检验本作物样品数的百分率表示。
二、品种纯度检验的方法分类
※品种纯度检验的方法很多，在实际应用中，理想的测定方法要达到4个要求：
※测定结果在不同实验室或同一实验室能重演；
※方法应简单易行；
※省时快速；
※成本低廉。
※第一大类形态鉴定又分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。
※籽粒形态测定虽简单快速，对于形态性状丰富的，可以作为鉴定前的简单分类，便于其他方法的利用。种苗形态测定，适合于幼苗形态性状丰富的作物，如十字花科、豆科等双子叶植物，种苗测定需要的时间一般在7～30天，因苗期所依据的性状有限，所以测定结果不太准确。植株形态测定，依据的性状较多，测定结果较准确，如田间纯度检验和田间小区种植鉴定都属于植株形态测定，但植株形态测定需要时间较长，难以满足在调种过程中快速测定的需要。
※第二大类物理化学法鉴定，又分为物理的方法和化学方法。
※物理方法如荧光鉴定法（fluorescence test）等，这些方法区别品种的种类较少，难以满足品种纯度准确测定的要求。
※化学方法（chemical method）主要依据化学反应所产生的颜色的差异区分不同品种，如苯酚染色法（phenol test）等。同物理法一样，化学方法区别品种的种类较少，也难以对品种纯度准确测定。但这类方法测定速度快，在实践中有一定的参考价值。
※第三大类方法生理生化方法，是利用生理生化反应和生理生化技术进行品种纯度测定。
※这类方法中包括的技术较多，以生理生化反应为基础的有愈伤木酚染色法，光周期反应鉴定法，除草剂敏感性鉴定法等。这些方法鉴别品种的能力较低，因此，测定结果不太准确。以生理生化技术为基础的方法有电泳法鉴定（electrophoresis method）、色谱法鉴定（chromatographic method）、免疫技术鉴定（immunolgy method）等。
※色谱法技术含量较高，免疫技术需要大量技术开发研究，目前两者难以在生产实际广泛应用。电泳法相对技术较为简单，依据蛋白质或同工酶电泳，可以相对较准确地测定品种纯度，是目前品种纯度测定中较为快速准确的方法。
v第四大类细胞学方法鉴定。
v细胞学方法主要依据染色体数量和结构变异、染色体带型差异以及细胞形态的差异区分种及品种，在品种纯度测定中应用价值不大。
v第五大类分子生物学方法。分子生物学方法种类非常多，它是在DNA和RNA等分子水平上鉴别不同品种。
v目前在品种检测中最常用的分子技术主要有RAPD技术（random amplified polymorphic DNA），SSR技术（simple sequence repeats，又称为microsatellite DNA），AFLP技术（amplified fragment length polymorphism）以及RFLP技术（restriction fragment length polymorphism）。分子技术在品种纯度测定和品种DNA指纹的制作方面具有广泛的用途。
v综上所述，品种真实性和品种纯度测定的方法非常多，但在生产实际中真正能广泛应用的方法较少。本章将主要以国家和国际标准为依据，介绍在品种纯度检验中有着广泛应用价值的方法。
v三、室内纯度测定的基本程序
v室内纯度测定的基本程序：从送验样品中随机数取一定数量的样品，测定异品种种子或杂株数，再计算样品纯度。
v品种纯度测定的送验样品的最小重量应符合表16-1的规定。样品纯度按下列公式计算：
※有时需要将测定结果与规定值比较。测定的结果（x）是否符合国家种子质量标准值或合同、标签值（a）要求可利用表16-2判别，如果︱a-x︱≥容许差距，则说明不符合国家种子质量标准值或合同、标签值要求。表中的容许差距，可以通过下列公式计算：
式中：T为容许差距；p为标准或合同或标签值；q为100－p；n为样品的粒数或株数。
表16-1 品种纯度测定的送验样品重量
第二节 品种纯度的形态测定
※品种纯度的形态测定是纯度测定中最基本的方法，又可分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株形态测定。因其依据的形态性状的多少、差异大小和可靠性，而影响测定结果的可靠性。在形态测定时主要从被检品种的器官或部位的颜色、形状、多少、大小等进行区别。
v一、种子形态测定
v籽粒形态测定特别适合于籽粒形态性状丰富、籽粒较大的作物。在测定时特别应注意因环境影响易引起变异的籽粒性状，同时该方法易受主观因素的影响。这一技术可以与计算机识别相结合对品种真实性和纯度进行快速测定，消除主观影响（Chuang等，1990）。
v二、生长箱测定
v（一）生长箱测定的应用
v生长箱测定可用于幼苗和植株形态测定。该方法可保证全部幼苗和植株都生长在同样的条件下，其品种形态特征的差异是遗传基础的表达。
v生长箱测定，可采用两种方法：第一种方法，给予幼苗加速生长发育的条件，可以鉴定如田间植株一样的许多性状，而大大缩短测定时间。第二种方法，将种子或植株种植在特殊逆境条件下，可对品种进行逆境反应差异的鉴定。
v当进行幼苗或植株的特别性状鉴定时，尽量按推荐的生长条件进行。如幼苗芽鞘、茎或下胚轴色素鉴定时，应将幼苗种植在石英砂或惰性砂砾中，并用特定营养液浇灌。含有磷的土壤营养将会影响幼苗花青素或紫色素的形成。强光照对花青素的发育是很重要的。当进行植株的抽穗、开花、颜色的形成鉴定时，将植株放在推荐的光周期下。为了促进花芽分化，有些品种的植株必须每天暴露在特别长的黑暗中。同时，开花或抽穗测定要求较长的测定时间，因此应供应适当的营养，确保鉴定植株的健康生长。
v应准备适当的对照样品，以便供检样品的性状或反应与对照样品进行比较。同其他方法一样，生长箱测定法也有其局限性。有些性状，如花的颜色、幼苗色素的差异是质量性状，既可用于真实性的鉴定，也可用于鉴定异型株；而株高、穗数等数量性状的测定只能用于真实性鉴定，不能用于鉴定异型株。
v（二）生长箱测定的程序
v1.种植
v（1）培养基质 为鉴定下胚轴、芽鞘、苗端的花青素或紫色素的发育，所有样品都应种植在无杂质的砂床里。用于除草剂赛克津敏感性测定的幼苗，也应种植在惰性砂床里。
v为鉴定花色、叶片特征，并且从播种至抽穗或开花需要较长时间的样品，应播种在惰性砂床里或灌溉土壤里。同时，必须以附加营养液进行处理。
v（2）种植密度 在播种小粒豆类、苜蓿时，每孔播入2粒种子，播深0.6cm，粒行距2.5×2.5cm，最后去除多余苗，达到每孔1株。在播种小麦、燕麦、玉米、高粱和莴苣时，播深lcm，粒行距2×4cm。在播种大粒豆类，如菜豆和大豆时，应播深2.5 cm，粒行距2.5×5cm。在播种小糠草时，粒行距为0.6×2 cm，播后用培养基质适当覆盖种子，并应用透明塑料薄膜盖好，待出苗后，揭去塑料薄膜，并间苗至行距为1.2cm。黑麦草种子可每孔播几粒种子，孔距为5cm，出苗后，间苗至每孔1株。经荧光测定的幼苗，也可移到培养基质上种植，株行距为5cm。
v2.浇灌方法
v在出苗前，全部种植盆应加水一致，并满足所有品种出苗所需。为鉴定色素而种植在砂床里的小糠草、莴苣和大豆幼苗，应用Hoagland No.1营养液（每升蒸馏水中加入1ml 1mol/L KH2PO4，5ml 1mol/L Ca(NO3)2和2ml 1mol/L MgSO4），每4天浇1次，而其他时间则用普通水浇灌。为鉴定芽鞘和茎上色素而种植的燕麦和小麦幼苗，应用缺磷的Hoagland营养液（每升蒸馏水中加4ml 1mol/L Ca(NO3)2，2ml 1mol/L MgSO4和6ml 1mol/L KNO3），每4天浇1次，其他时间用普通水浇。为鉴定色素而种植在砂床里的高粱和玉米幼苗，应每天浇水。种植在土壤里的幼苗可不用Hoagland No.1营养液而只需用普通水,因为土壤通常含有营养供应。
v当测定大豆幼苗对除草剂赛克津敏感性时，可采用Hoagland No.1营养液溶解入0.30×10-6的赛克津(metribuzin)，按每平方厘米盆表面O.37ml赛克津溶液，每天直接喷施在种植盒上面。应用赛克津敏感性测定，要在幼苗小叶叶片完全展开时进行。如在第10天应用，赛克津溶液增加到O.56ml／cm2。
v3.光照要求
v（1）光照强度
v生长箱测定应利用高强度的光照，白冷光荧光灯33000 lx（勒克斯），白炽灯3000 lx的光照强度。如果用较低的光照强度，有时会引起花色素发育的减少，导致幼苗色素的差异不明显。为鉴定大豆植株光周期（开花），只能种植在荧光灯下，而不能利用白炽灯。
v（2）光周期
v在测定小麦、燕麦、高粱、玉米、黑麦草、莴苣、苜蓿和大豆样品时，应用24h连续光照的光周期，但赛克津敏感性测定和光周期测定除外。当进行大豆幼苗赛克津敏感性测定时，需用16h光照和8h黑暗交替的光周期。菜豆样品应种植在20h光照和4h黑暗交替的光周期。在测定大豆样品开花期时，可利用13.5、15.5和18h光照的光周期，当然，还取决于供检样品成熟期的不同。
v4．温度控制
v一般农作物绝大多数样品可种植在25℃温度条件下，埃及三叶草可种植在10℃下。一般认为，低温可促进花青素的发育。如果最大的光照强度仍比前面建议的数值低，那么，应降低生长箱的温度，用低温来补偿低光照，促进幼苗花青素的形成差异。这里将生长箱鉴定品种的适合方法见表16-3。
表16-3 生长箱测定的播种和幼苗管理
注：1. 每孔播种数粒种子，最后间苗留l株； 2.Hoagland No.1营养液； 3.缺磷Hoagland No.1培养液
注：1. 每孔播种数粒种子，最后间苗留l株； 2.Hoagland No.1营养液； 3.缺磷Hoagland No.1培养液
5．幼苗和植株鉴定
关于幼苗和植株性状的鉴定方法列于表16-4。
（1）玉米、高粱 可在出苗后第14天进行高粱幼苗芽鞘和顶端颜色鉴定。芽鞘颜色可分为紫红色或绿色。顶端颜色可能有4种类型：深紫色(在茎和叶的近轴和远轴表面全深紫色)、中等紫色(紫包茎，近轴叶表面几乎深紫色，但远轴叶表面为黄棕色)、浅紫色(幼苗在茎和叶边缘有局部紫色，主要为绿色)和绿色(幼苗完全绿色)。如利用比建议较低的光照强度，也可能用于区分品种，以及鉴定异型株。
v（2）大麦 播种10天至2周可以坚定胚轴或叶鞘花青苷。播种3-4周可以鉴定品种间的胚轴长度和株高差异。播种4-6周，大麦品种可以记录抽穗（春大麦）或不抽穗（冬大麦）。春性品种还可以评定穗上的芒颜色（红或绿）和其它性状。这些观察可作为品种分类，也可作为鉴定异型株。
v（3）小麦 小麦幼苗的芽鞘和茎色的鉴定，可在播后大约第7天进行。其颜色可分为紫色和绿色。抽穗情况的记载可在出苗后30天左右进行。抽穗情况可分为正在抽穗(春小麦)、未抽穗(冬小麦)。该法可用于区分品种，及检出异型株。
v（4）十字花科
v在子叶期根据子叶大小、形状、颜色等性状鉴别。第一真叶期根据第一直叶形状、大小、颜色、茸毛多少、长短、叶脉宽窄及颜色、叶缘特性等鉴别。将种子播于砂盘内，粒距1cm，20～25℃培养。发芽7天后鉴定子叶性状，15～20天鉴定真叶性状。
v（5）莴苣 可以根据幼苗的下胚轴颜色(粉红色或绿色)、第一叶叶色(红、粉红、浅绿或深绿)、叶缘(深裂、全缘或浅裂)、叶卷曲(似管形或展开)、子叶形状(宽或窄)等性状进行鉴定。鉴定时期为播种后三周或三至四叶期。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。
表16-4 种植在生长箱测定条件下幼苗和植株性状的鉴定方法
注：1.用于区分栽培品种，以C表示；2.用于检出异型株，以OT表示；3.用于区分种(类)，以S表示；4.用于区分类型，以T表示。
※（6）菜豆 菜豆品种的植株可依据花色(紫色、白色花) 和从播种至开花的天数进行鉴定。从播种至开花大约需4～6周鉴定。该法可用于区分栽培品种和检出异型株。
※（7）燕麦 可在播后第10～14天对燕麦幼苗的芽鞘和叶鞘颜色(红色或绿色)和叶鞘茸毛进行鉴定。其幼苗可按茸毛有无，光滑或混合(有些幼苗光滑，而有些有茸毛)进行分类。该记载可在播后30天进行。燕麦植株也可进行抽穗(春燕麦品种)或不抽穗(冬燕麦品种)检查。该检查可用于区分栽培品种，并附带检出异型株。
※（8）洋葱 出苗后几天，在砂上长出的部分可评定为红叶或绿叶。播种后四周，检查是否形成球茎，记录从播种至球茎形成的时间。在球茎形成时记录株高和球茎(而葱不形成球茎)。播种后12周，在容器中生长的植株至少17 cm，检查球茎的形状和颜色、叶姿和叶蜡。该法可用于栽培品种分类和鉴定异型株。
※（9）大豆 大豆幼苗花青素鉴定，可在播后第10～14天进行。如果幼苗是培育在原来说明的条件下，则可能观察到4种苗色：绿色(仅有绿色素)、赤褐色(下胚轴下部有赤褐色素)、淡紫色(下胚轴紫色，上胚轴绿色)和深紫色(上胚轴和下胚轴均为紫色)。同时在播后第21天，待3片小叶完全展开时，可进行上面一片小叶背面茸毛角度的鉴定。小叶茸毛角度可分为直角、紧贴、中等；茸毛颜色可分为黄褐色、灰色；小叶形状可分为卵形(长／宽比少于1.6)、尖形(长／宽比大于2)。该法适用于区分品种和检出异型株。
※在大豆幼苗赛克津敏感性测定时，应每天记载植株的伤害情况。其伤害症状有呈现出褐色斑点、干枯和叶片卷曲、叶片下垂和植株死亡情况。按伤害等级，可将品种分为最敏感(约9天后植株出现伤害症状，第17天后枯死)、中等敏感(第13天幼苗出现病症，第32天死亡)、不敏感(第20天幼苗出现症状，第38天后仍存活)。
※大豆光周期的测定，在不同光周期条件下，记载从播种至开花的天数。该法可将大豆栽培品种分为不同成熟期的类群。
第三节 品种纯度的快速测定
※在品种纯度的测定中通常把物理法鉴定、化学法鉴定等在短时间内测定品种纯度的方法归为快速测定方法。本节将以国际标准和国家标准为依据介绍部分快速的品种纯度测定。
一、苯酚染色法
（一）苯酸染色法的机理
※苯酶染色法已作为ISTA和我国国家标准。苯酚染色法的机理有两种观点，一种认为是酶促反应，另一种认为是化学反应。
※该反应受Fe++、Cu++等双价离子催化，可加速反应进行。Na+离子（NaOH、Na2CO3）等对该反应有抑制作用（Chandra，1977，Jaiswal和Agrawal等，1995）。其反应可用下式表示：
（二）苯酚染色的方法
※1．麦类
※（1）国际标准法 数取净种子400粒，每重复100粒。按以下方法测定。将小麦、大麦、燕麦种子浸水18～24小时，用滤纸吸干表面水分，放入垫有1%苯酚溶液湿润滤纸的培培养皿内（腹沟朝下），室温下小麦保持4小时，燕麦2小时，大麦24小时后即可鉴定染色深浅。小麦观察颖果颜色，大麦、燕麦观察内外稃的颜色，一般染后的颜色可分为不染色、淡褐色、褐色、深褐色、黑色五种，将与基本颜色不同的种子取出作为异品种。
※（2）快速法 将小麦种子用1.0%的苯酚浸15分钟，取出放在铺有1%苯酚湿润过的滤纸的培养皿中（腹沟朝下），并盖上贴有同样滤纸的培养皿盖。置30～40℃温箱内，染色0.5～1小时，观察染色结果，区分本品种与异品种。
※2．水稻
※将种子浸水6小时，取出放入1%苯酚溶液中，室温下12小时，然后取出用清水洗涤，放在湿润的滤纸上24小时，观察谷粒或米粒染色程度。谷粒染色分为不染色、淡茶褐色、茶褐色、黑褐色和黑色五级，米粒染色分为不染色、淡茶褐色、褐色三级。
二、愈伤木酚染色法
（一）愈伤木酚染色的原理
※愈伤木酚（C7H8O2）是专门用于大豆品种鉴别的方法。Buttery和Buzzell（1968）根据大豆种皮内过氯化物酶活性的高、低，把大豆品种分为两大类。其原理是：大豆种皮内的过氧化物酶，可催化过氧化氢分解产生游离氧基，游氧基可使无色的愈伤木酚氧化产生红褐色的邻甲氧基对苯醌，种皮内含有的过氧化物酶活性越高，单位时间内产生的红褐色的邻甲氧基对苯醌越多，溶液的颜色越深。反之，颜色越浅。不同品种由于遗传基础不同，过氧化物酶的活性不同，在一定条件下，溶液染色的深浅不同，依此区分不同品种。
（二）愈伤木酚染色的方法
※方法是将大豆种皮逐粒剥下，分别放入指形管内，然后注入1ml蒸馏水，在30℃下浸泡1小时，再在每支试管中加入10滴0.5%愈伤木酚溶液，10分钟后，每支试管加入1滴0.1%过氧化氢溶液，1 分钟后根据溶液呈现颜色的差异区分本品种和异品种。
※使用该方法时应注意，剥种皮时的碎整程度要一致，否则影响染色的深浅，进而影响测定结果。最好使用小的打孔器，将种皮打下，这样克服了种皮大小及碎整程度的影响。
三、荧光分析法
※紫外光能量较高，当照射物体时，就会产生光激发现象，被激发的电子很不稳定，由高能态转变为低能态时，便会发现一种可见光——荧光。因作物和品种不同，其种皮结构和化学组成不同，在紫外光照射下发出荧光的波长不同，因而产生不同颜色。荧光分析可对种子或幼苗进行测定。
（一）种子鉴定
※取净种子400粒，分为4次重复，分别排在黑板上，放在波长为360nm的紫外分析灯下照射，试样距灯泡最好为10～15cm，照射数秒或数分钟后即可观察，根据发出的荧光鉴别品种或类型。
※如蔬菜豌豆发出淡蓝或粉红色荧光，谷实豌豆发褐色荧光；无根茎冰草发淡蓝色荧光，伏枝冰草发褐色荧光。十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色，白芥为鲜红色，黑芥为深蓝色，田芥为浅蓝色。
（二）幼苗鉴定
※国际上主要用于黑麦草与多花黑麦草的鉴别。取试样二份，各100粒，置于无荧光的白色滤纸上发芽，粒与粒之间保持一定距离，于20℃恒温或20～30℃变温培养。黑暗或漫射光，发芽床保持湿润，经14天即可鉴定。将培养皿移至紫外灯下照射，黑麦草根际不发光，多花黑麦草根际发蓝色荧光。羊茅与紫羊茅也可用同样的方法进行鉴定，但幼苗鉴定前发芽床上先用稀氨液喷雾，然后置于紫外灯下照射，羊茅根发蓝绿色荧光，而紫羊茅则发黄绿色荧光。
※除以上三种方法外，还有：
※利用碱液处理区分红白皮小麦，进行十字花科品种真实性鉴定；
※利用漂白水处理，区分单宁含量不同的高粱品种；
※利用I-KI溶液区分直支链淀粉含量不同的水稻品种；
※利用除草剂敏感性鉴定转除草剂基因大豆；
※利用抗生素基因，检测转基因作物等。
※这些方法仅仅依据个别性状或个别特性进行品种的检测，只能将品种区分成少数几类。
第四节 品种纯度的电泳测定
一、品种纯度电泳测定的发展
※电泳是指溶液中的带电粒子在电场中移动的现象。这一现象在19世纪就已发现，并用于胶体化学的研究中。直到1937年Tiselius开发了蛋白质泳技术，并成功地用这种方法分离了血清蛋白之后，才使这一技术在生物研究中得到广泛地应用。电泳的种类繁多，有不用支持物电泳和用支持物的电泳两大类，在生物研究中，支持物电泳用的最多，特别是聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）因其凝胶透明度高、弹性好、无吸附性、浓度易控制，应用最为广泛。聚丙稀酰胺凝胶电泳又分为圆盘电泳和平板电泳两种，在品种纯度测定中主要应用平板电泳。
※目前鉴定品种的常用电泳方法：
※（1）国际种子检验协会
※鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳标准程序、
※鉴定豌豆属和黑麦草属的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准方法、
※超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米种子纯度的标准方法
※列入国际种子检验规程，在全世界推广应用。
※（2）国际植物新品种保护联盟于1994年制订有关电泳技术标准将分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法列入DUS检测应用。
※（3）我国GB/T 3543农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用。20##年农业部颁布了“玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法”（NY/T449－2001）。
二、电泳法测定品种纯度的原理
（一）电泳法测定品种纯度的遗传基础
※电泳法测定品种纯度主要利用电泳技术对品种的同工酶及蛋白质的组分进行分析，找出品种间差异的生化和分子指标，以此区分不同品种。
※目前品种鉴定主要以同工酶和蛋白质为电泳对象。同工酶是指同一生物体或同一组织中催化相同化学反应，结构不同的一类酶。从遗传法则（DNA→RNA→蛋白质（或酶））知道，蛋白质或酶组分的差异最终是由于品种遗传基础的差异造成的，因此分析酶及蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种差异，利用先进的电泳技术可非常准确地分析种子蛋白质或同工酶的差异，进而区分不同品种，测定品种纯度。
※种子内的蛋白质或同工酶是在种子发育过程中形成的，它只反映了种子形成过程中的遗传差异。因此，有些作物种子中的贮藏蛋白或同工酶有时品种之间没有差异，这就需要研究哪一类蛋白质（或同工酶）在品种之间存在差异，以此作为该作物纯度电泳的对象——生化指标。
※应该指出的是同工酶往往具有组织或器官特异性，即同一时期不同器官内同工酶的数目不同。如过氧化物酶同工酶在玉米幼苗中有5种，叶片中有5至6种，干种子内有2种。此外同工酶在不同发育时期，数目也不同。Scandalios（1974）曾列出过46种同工酶系统，它们的酶谱皆随发育阶段或营养状况而改变。
※由于某些同工酶在种子贮藏和萌发过程中，种类数目易随生活力和发育进程的变化而变化，加之种子萌发速度不一致，所以对品种纯度鉴定不利。此外，酶的提取和电泳条件较蛋白质要求严格，需在低温下进行。因此，在纯度鉴定的研究中，应以蛋白质为主。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
※聚丙烯酰胺通过交联剂（甲叉双丙烯酰胺，Bis）在催化剂的作用下聚合而成的高分子胶状聚合物。其凝胶透明，有弹性，机械强度高，可操作性强；化学稳定性好，对pH、温度变化稳定；该凝胶属非离子型，没有吸附和电渗现象；并通过改变丙烯酰胺和交联剂的浓度可有效控制凝胶孔径的大小。因此，在品种纯度电泳分析中广泛应用。
※蛋白质（或酶）为两性电解质，在不同pH条件下所带电荷多少不同。不同的蛋白质（或酶）由于氨基酸的组成不同，其等电点pI也不同，在同一pH条件下所带电荷也就不同。因此在电场中受到的作用力大小也就有差异。聚丙稀酰胺凝胶电泳主要依据分子筛效应和电荷效应对蛋白质（酶）进行分离。
※分子筛效应是指由于蛋白质分子的大小、形状不同在电场作用下通过一定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同，小分子较易通过，大分子较难通。随丙稀酰胺和交联剂浓度的增加，凝胶孔径变小，反之孔径变大。小孔径凝胶适于小分子蛋白质（或酶）的分离，大孔径凝胶适于大分子量蛋白质（或酶）的分离。一般分子量1～10万的蛋白质可用15～20%的凝胶；10～100万的蛋白质用10%左右的凝胶；大于100万的可用小于5%的凝胶。
※电荷效应是指由于蛋白质带的电荷多少不同，受电场的作用力不同，电荷多受到的作用力大移动较快，反之，较慢。溶液的pH值与蛋白质的pI相差越大，蛋白质带电荷越多。蛋白质在凝胶中的运动速度与荷质比有着密切关系。经过一定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分离。
※描述蛋白质泳动速度一般用迁移率m或相对迁移率Rf值表示：m=dl/vt，m为迁移率（cm2/伏特、秒）；d为蛋白质谱带移动的距（cm）；l凝胶的有效长度（cm）；v电压（伏）；t电泳时间（秒）。
三、品种纯度电泳检测的一般过程
（一）品种纯度电泳检测的一般过程
※电泳的方法很多，不同方法其具体操作过程也有差异，具体参见相应的标准和方法。在品种纯度电泳测定时一般包括：样品的提取、凝胶的制备、上样电泳、染色观察等步骤。
※应注意的是，电泳测定时，在不同混杂率的情况下，保证测定结果的可靠性所需要的样本粒数不同，可参考表16-5。
表16-5 电泳所需样品数量
第五节 品种纯度的分子测定技术
一、常用分子技术的原理及特点
※20世纪90年代分子技术发展迅速，到目前为止，依据所采用的分子生物学技术的原理不同，?常用的DNA 分子标记大致可分为三类：
※第一类以分子杂交技术为核心，可分为RFLP标记 (限制性片断长度多态性)，VNTR标记 (Variable Number of Tandem Repeats，重复数可变的串连重复单位) 以及原位杂交（in situ hybridization）。
※第二类以PCR 技术为核心，可分为RAPD标记 ( 随机扩增多态性DNA)，SSLP 标记（Simple Sequence Length Polymorphism，简单序列长度多态性），SCAR标记 (Sequence Characterized Amplified Region，特征序列的扩增区域)，STS(Sequence Tagged Site，序列标记位点)，SNP标记(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性) 和AFLP 标记 (Amplyfied Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性) 等。
※第三类是以重复序列为基础的分子标记，可分为小卫星标记（Microsatellite DNA）、微卫星标记（Minisatellite DNA）、SSR标记 (Simple Sequence Repeats 简单重复序列) 和ISSR 标记(Inter-Simple Sequence Repeats ?简单序列重复区间)。
1．RFLP标记技术
※RELP技术始于1974年（Grodzicker等），1980年由Botstein等再次提出。它是以DNA-DNA 杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP 标记的基本原理是用放射性同位素标记探针，与经酶切消化后的基因组DNA 进行Southern杂交，通过标记上的限制性酶切片断大小来检测遗传位点的多态性。基本操作步骤分别为：DNA 的纯化、酶切、凝胶电泳分离DNA 片段、转膜、利用放射性同位素标记的DNA 探针进行Southern 杂交并放射自显影和结果分析。
※RFLP标记有以下优点：(1) 无表型效应，不受环境影响；(2) 呈简单的共显性遗传，可以区别纯合基因型与杂合基因型；（3）在非等位的RFLP 标记之间不存在上位效应，互不干扰。缺点：该方法所需的DNA 用量大，耗费成本高，操作烦琐，技术复杂，工作量大，且检测所需的放射性同位素对人体有害。
2. RAPD标记技术
※RAPD 是1990 年Williams 和Welsh 等人发明的基于PCR原理的分子标记技术，它利用随机引物(通常为10个碱基) 对不同品种的基因组DNA 进行PCR 扩增，产生不连续的DNA 产物，再通过电泳分离检测DNA 序列的多态性。RAPD 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行多态性分析, 而且具有方法简便、快速、DNA 用量少、成本较低、灵敏度高、无放射性污染等优点。
※但是RAPD 分析中存在的最大问题就是引物比较短，对反应条件极为敏感，稍有改变便影响扩增产物的重现，重复性较差，稳定性不好,而且RAPD 是显性标记，不能区分杂合型和纯合型，这些不足在一定程度上限制了它的应用。
图16-1 PCR原理示意图
3. AFLP标记技术
※AFLP 技术是由荷兰Keygene 公司科学家Zabeaumare 和Vospieter 等发明的一项专利技术，它实质是RFLP 和PCR 两项技术的结合，具有RFLP 的可靠性和PCR 技术的高效性。AFLP的原理及操作步骤如图16-2所示：首先将基因组DNA 用限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机性片段，而后将特定的接头连接在这些DNA 片段两端形成带接头的特异片段；再利用2个引物(该引物含接头序列，且在其3 ’端加上1个随机碱基) 对其预扩增，再设计2 个较长的选择性引物(该引物含上述引物的序列，且在其3 ’端再加上2 个碱基) 进行选择性扩增，最后进行电泳分析。它的优点主要有：(1) 标记异常丰富，典型的AFLP 反应中，利用聚丙烯酰胺凝胶一次可以检测100~150 个扩增产物；(2) 稳定性、重复性好；(3) 呈共显性表达，不受环境影响，无复等位效应；(4) 带纹丰富, 灵敏度高，快速高效，只需极少量的DNA 样品，不需要Southern 杂交，也不需要预先知道DNA 的序列信息,。
※但是，AFLP 标记也有缺点：(1) AFLP 是一种专利技术，受专利权保护；(2)AFLP 操作难度大，基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA 纯度和内切酶的质量要求较高，操作程序长、步骤多，并要求很高的实验技能和精密的仪器设备，一般实验室难以完成。
4．SSR标记技术
※在人类及动植物的基因组中，均存在着由几个核苷酸(2~5 个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，我们称之为简单重复序列。由于它的重复单位数目是高度变异的，且每个微卫星DNA 两端的序列一般都是相对保守的单拷贝序列，因而根据其两端的序列设计一对特异引物，通过扩增产生重复序列长度多态性。
※SSR是一种较理想的分子标记，它具有以下一些优点：① 以孟德尔方式遗传，呈共显性，可以区分纯合基因型和杂合基因型；② 具有多等位基因特性，多态性丰富，信息含量高；③ 数量较为丰富，覆盖整个染色体组；④ 实验程序简单，耗时短，结果重复性好；⑤易于利用PCR 技术分析，所需DNA 量少，且对其质量要求不高，即使是部分降解的DNA 样品也可以进行分析；⑥ 技术难度低，实验成本较低；⑦ 很多引物序列公开发表，易在各实验室广为传播使用。因此，该技术一经问世，便很快在动植物的遗传分析中得到了广泛的应用。然而，开发和合成新的SSR 引物投入高、难度大，需要通过构建SSR 基因库，筛选阳性克隆，测定新的SSR 序列，设计位点特异性引物，是一个过程繁琐、工作量大、效率低且花费很大的工作。
5．其他技术
※除了以上介绍的4种常用分子标记技术，还有STS技术、SCAR技术、ISSR技术以及SNP（single nucleotide polymorphism）技术。
※STS引物的序列是特定的，对于任何一个能克隆测序的位点都可以设计特定的引物，进行扩增。因此RFLP标记、AFLP标记及RAPD标记又都可以通过测序转化为STS。
※SCAR技术是由RAPD技术派生出来的，是根据测定的RAPD克隆片段的末端序列，在RAPD引物的基础上加上14个bp形成24个bp的特定引物，以扩增特定区域。SCAR技术类似于STS技术。
※ISSR 的引物序列通常为16～18个碱基，由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的特定碱基组成，从而保证了引物能与基因组DNA中简单重复序列的5’或3’末端结合进而扩增简单重复序列的之间的DNA片段。ISSR不需知道DNA序列就可设计出引物。
※SNP是动植物基因组中普遍存在的一种标记，是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，被称之为是继以酶切、杂交为基础的分子技术和以PCR为基础的分子技术之后的第三代分子技术。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。较普遍的DNA序列变异是单个碱基的差异，包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，即单核苷酸多态性(SNP)，这是等位基因间序列差异最为普遍的类型。SNP可以通过基因测序（sequencing）、毛细管电泳（capillary electrophoresis）、变性高效液相色谱检测（DHPLC）和基因芯片（DNA chip）等技术检测。
二、分子技术在品种纯度检测中的应用
（一）RAPD技术在品种纯度检测中的应用
※目前，RAPD 技术已被广泛用于进行种子纯度检验的研究。国际上，Tinker（1993）利用RAPD方法分析了27个大麦品系，结果认为RAPD方法是区别高度相似的大麦品系的有用方法。McDonald（1994）对玉米、大豆、花生、棉花、小麦进行RAPD检测，根据结果认为RAPD技术是鉴定品种纯度的有效的方法。
※近年来，国内的研究人员也开展了类似的研究。在农作物方面，研究主要集中在玉米上。
※RAPD 检测种子纯度的实践中，需要经过以下四个步骤：
※种子或种子萌芽、DNA 提取、特异引物筛选、RAPD 检测。
※为了确保RAPD 标记检测作物种子纯度法在实践中得到成功的应用，必须建立简便、快速的DNA 提取方法。而且RAPD 标记对反应条件十分灵敏，因此RAPD 标记检测作物种子纯度时必须使RAPD 反应标准化、程序化，另外必须建立每种作物品种种子纯度RAPD 检测技术操作规程，这样检测结果才可靠、准确。
（二）SSR技术在品种纯度检测中的应用
※到目前为止，SSR 技术已在许多作物及蔬菜的品种纯度检测上得到应用。国际上，Akaagi等(1997)采用20个微卫星位点分析了59个日本粳稻品种的多样性，发现17个微卫星位点能够将59个品种区分开，大部分品种可通过5个微卫星位点加以鉴定。Smith等（1997）利用131个SSR引物和80个探针对58个玉米自交系和4个杂交种进行了鉴定，结果显示SSR比RFLP能更有效的鉴定玉米种质。
※在国内，SSR技术也已被广泛用于各主要作物及蔬菜的品种纯度检测。
（三）AFLP技术在品种纯度检测中的应用
※AFLP技术不仅重复性好，而且多态性高，在聚丙烯酰胺凝胶上一次可以扩增50-100条带，因而非常适合品种真实性鉴定和纯度分析。著名的美国先锋公司首先应用AFLP技术进行玉米自交系和杂交种的鉴定工作，建立指纹档案，保护品种专利。Smith 等(1993) 利用AFLP 技术对44 个玉米自交系进行分析，认为AFLP 是一种很准确的方法，可以将亲缘关系很近的自交系区分开。
※尽管AFLP技术非常适合品种真实性鉴定和纯度分析。但由于该技术已经申请了专利,受专利权保护而限制了它在商业及生产上的应用，因而难以在作物种子纯度及真实性鉴定中普及应用。
三、几种常用分子标记技术在品种纯度检测中应用的可行性分析
※通过比较可以发现，RFLP 标记需要的DNA 量多、检测过程复杂、费用高，不易在种子纯度检测中推广应用。
※RAPD 标记需要的DNA 量少，分析程序简单，但重复性和稳定性较差，在种子纯度检测过程中应用还存在局限性。
※AFLP 的多态性检出率最高，但该技术受专利保护，进入商业化应用受到一定限制；另外由于AFLP 多态性检出率高，样本内个体之间细微的差异都能检测出，因此在利用AFLP 进行种子纯度鉴定时，容易出现很多假杂株，与实际情况不符，而且AFLP 操作复杂，试验周期长，对DNA 质量要求高，因此AFLP 不太适合应用于种子纯度的快速鉴定。
※SSR 标记数量丰富，多态性信息量高，呈共显性?遗传，既具有所有RFLP 的遗传学优点，又避免了RFLP方法中使用同位素的缺点，且比RAPD 重复度和可信度高，检测结果准确可靠，重复性好，操作简便、快速；另外SSR 分子标记技术对DNA 数量及质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析。
※虽然SSR开发费用较高，但目前包括玉米在内的多种作物中已有一大批现成的公开发表的SSR 位点引物序列可免费利用。随着更多多态性SSR 位点的开发及SSR 检测技术的进步与普及，这一技术将在种子纯度及品种真实性鉴定中得到广泛应用。
几种常用的DNA分子技术特点比较如表16-6
表16-6 几种常用分子技术特点比较
第十七章 转基因种子特定特性测定
第一节 概述
一、植物转基因品种鉴定的重要性
※随着生物技术产品(转基因品种)的问世，植物转基因品种鉴定问题日益突出。随着植物转基因品种的不断育成和商业化应用，在种子质量检测中出现了新的挑战，这就是植物转基因品种种子的鉴定问题。
二、转基因作物的发展
※根据国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）的统计，全球转基因作物栽培面积发展迅速，20##年上升至8100万公顷，占全球可耕地面积的5%，是1996年开始转基因作物播种以来年度第二大增幅(表17-1、17-2)。转基因作物栽培面积从1996年的170万公顷到20##年的8100万公顷，9年间增加了47倍多。在各种作物中以转基因大豆的种植面积最高，20##年达到4840万公顷。20##年世界转基因作物的播种面积以20%速率增长，比20##年增加13.3百万公顷。由于更多的第三世界国家选择播种转基因作物，到20##年底播种面积将会大幅增长。
表17-1 全球转基因作物栽培面积的发展 (百万公顷)
表17-2 20##年占优势的转基因作物面积及性状
三、种子批中GMO含量测定的目的
种子批中GMO含量测定的目的：
※一是检测（Detection），确定种子批中是否含有GMOs ；
※二是鉴定（Identification），如果检测的结果是阳性的，需要通过鉴定知道GMOs 是否是经授权的，如果未经授权，种子批将被拒绝。如果是经授权，则进一步定量分析；
※三是定量（Quantification），即通过定量分析，确定种子批中的GMO是否超过极限值。
※关于极限值，欧盟20##年规定常规种子批中含有外来GMO的最大界限值是：甜油菜（sweet rape）0.3%，番茄、甜菜、棉花、菊苣、玉米和马铃薯0.5%，大豆0.7%，其它未经权威机构批准的基因为0.0%。当超过极限值时，种子批应标注出含有“％GMO”。
四、ISTA对GM0测定开展的工作
1.成立GMO测定特别小组和发表了转基因种子检测发展策略
※随着全球转基因种子迅速增加和GM0测定任务的日益紧迫，ISTA为适应GM0测定的需要，建立了ISTA GMO测定特别小组(ISTA GMO Test Force)，并发表了转基因种子检测的发展策略。
2.开展能力验证活动
※ISTA为了检查全球种子实验室对GM0测定的能力，从20##年5月开始，已完成了4轮ISTA GMO测定能力验证活动(ISTA Proficiency Test On GMO Testing)。前3轮测定转基因玉米种子，第4轮测定转基因大豆，由ISTA配置好样品，送往各实验室进行测试，先后有来自30个国家的90个实验室参加了测试。每次测试的结果，经分析后，在ISTA的种子检验国际期刊（Seed Testing International）中公布，前4轮的样品测定正确率分别为95.4%、96.4%、95.9%和97.1%。目前，第5轮和第6轮能力测试正在进行中。
3.制定 GMO测定国际规程
※在GMO测定特别小组中建立了规程工作组，制定转基因种子测定的国际规程。该规程已在20##年于泰国召开的年会上通过，将于20##年2月开始实施。
4．加强信息交流
※加强转基因种子检测信息的交流，特别是通过举办培训班的方式。
第二节 检测方法
一、国际规程对转基因种子检验方法采用一种全新的规定
※国际种子检验协会（ISTA）对于转基因检测方法的规定采用了一种全新的方法，这种方法称为“以性能为基础检测方法”。以性能为基础的检测方法意味着检验室可以研发和（或）使用一种在国际种子检验规程中还未公布的方法，并且一旦当检验室通过性能数据正式认可该方法后，就可以申请国际种子检验协会授权使用该检测方法。
※国际种子检验协会除了发布检验规程外，还发布了“以性能为基础检测方法的实验室认可原则与条件”和“性能数据评价文件”两个文件。
种子检测室签发转基因种子结果报告，必须满足：
※ 检测室必须达到国际种子检验协会种子检验室认可标准系列文件所规定的认可资格要求；
※通过性能认可的方法仅限于对指定特性的检测（见国际种子检验规程8.2.2条）；
※技术能力评价包括参与能力验证和检测方法性能认可的数据；
※只有依照相关性能数据评价文件对以性能为基础的检测方法进行评价后，认可才会授权。
二、检测方法概述
※目前常用大田作物(玉米、大豆和棉花等)GM种子检测方法主要有：
※PCR定性和定量分析
※酶联免疫检测(ELISA)
※生物测定(表现型性状生化检测等)。
三、生物表现型检测方法
※生物表型检测需做发芽试验，培育幼苗，观察幼苗是否具有GM的特定性状(如抗虫或耐除草剂等)，而非GM幼苗在除草剂处理的培养基上则受伤害或死亡，从而区分出耐除草剂的GM幼苗。
四、特异蛋白质检测方法
1.酶联免疫检测
※ELISA是一种免疫化学测定，它是利用遗传改良作物导入基因所产生蛋白质的定量测定。其重要成分是GM高度特殊蛋白质的抗体。该法可定性和定量测定种子样品所提取的GM蛋白质。其方法是将对GM蛋白质的抗体吸附在ELISA微孔板(microtiter．plate)上作为固相，然后将从种子样品提取的蛋白质溶液加到微孔板，温育使抗体与靶蛋白联合，然后将微孔板进行洗涤。再将用于测定抗体与GM蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加入微孔板。第二抗体与酶偶联的作用可形成一种检测信号的标记。例如，如存在GM蛋白质，则可形成一种颜色产物，这就可用分光光度测定，或肉眼确定。
※测定极限为在1000粒中少于l粒种子。利用已知浓度GM蛋白质标准和阴性对照与样品比较就可实现定量测定。查对预先制备已知浓度靶蛋白的标准曲线，就可估测GM蛋白质数量。
※ELISA的优点是要比PCR省成本，且比PCR和生物表现型测定快。包括样品准备(种子样品磨碎和GM蛋白质提取)时间在内数小时就可获得结果，并高度专化，分析样品仅需简单的准备。
※但是变性蛋白质(如食品加工所引起变质)由于不能与抗体结合而引起测定困难。ELISA与PCR方法比，较少出现假阳性的风险。由于ELISA不能判别不同转基因之间不同表达形式和类型，因此每个性状需要分开测定。
2.横向侧流条测定
※横向侧流条测定(Lateral Flow Strip)是一种快速稳定的定性测定，检查GM蛋白质是否存在。
※其方法是利用试剂盒的带有抗体的纸条或塑料浆片直接浸一下样品提取液。如果样品提取液中存在GM蛋白质，试纸上抗体与GM蛋白质之间就会发生反应，引起横向流式纸条颜色的变化，而确定GM蛋白质的存在。如果测定程序是适合的，那末测定界限小于0.15％。
五、DNA检测方法
1．定性PCR测定
※迄今，最好的定性GM种子分析方法是利用PCR测定导入作物植株基因的特定DNA序列是否存在。PCR可对插入两个已知DNA序列之间的特定DNA序列进行特别和灵敏的扩增(多重)。通常，导入的基因结构（基因卡盒）由3部分构成：启动子(Promoter)、结构基因(Structural gene)、终止子(Terminator)。在测定前，至少应该知道这3种中的任何1种，PCR就能用于测定其中任何一种基因，或者来自启动子和终止子DNA标记。
PCR基本测定主要包括3个步骤：
※DNA提取和纯化，
※插入DNA的PCR扩增，
※PCR扩增产物存在的电泳确认。
※每个步骤均会影响测定结果的可靠性和灵敏度，因此，全部3个程序都应在最佳状态下操作。
2.定量PCR测定
※定量PCR测定有几种方法。主要有：
※①竞争PCR(Competitive PCR)
※根据目的序列合成一种突变的DNA序列作为竞争模板，竞争模板与目的序列十分相似，可共用一套引物，根据扩增后这两种DNA的含量和已知的竞争模板起始DNA浓度，确定目的模板的起始DNA浓度。
※②实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)
※定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团（reporter）和一个淬灭荧光基团(quencer)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
※该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。该方法不需进行电泳，计算机将直接记录和告知结果。
※这种测定灵敏度很高，能测出作物遗传材料里1个或几个基因拷贝，这是该测定方法的重要优点。但其主要缺点是花时间(需2-3天)，并且成本高，PCR容易出现假阳性结果。还有每个性状需分开测定。
※到目前为止，由于转入基因和作物的种类繁多，尚难有统一的转基因种子检测标准方法。
六、检测技术流程
※基于PCR的种子样品分析流程如下：
※1. 根据 ISTA 规程扦样。扦样前，扦样器等用具必须用吸尘器清扫干净。
※2. 选择测定方法和测定方案。一般实验室的鉴定，已经知道目的基因，只针对这一基因进行鉴定，方法有针对性。而商业鉴定，不知道是何种基因转入该作物中，因此，需要制定测定方案。
※3. 准备工作样品。至少1000 粒种子重，如玉米可用1千克种子。
※4. 磨粉并混匀。在测定时，种子样品应充分混和，磨碎应均匀。
※5. 取粉样。
※6. DNA 提取。
※7. DNA 量化（quantification）。
※8. PCR- 定性qualitative (electrophoresis)或定量quantitative (e.g. real time detection of fluorescence) 分析。
※9. 评价和报告结果。
第十八章 种子健康测定
第一节 概述
一、种子健康测定的目的和重要性
※种子健康测定主要是测定种子是否携带有病原菌(如真菌、细菌及病毒)，有害的动物(如线虫及害虫)等状况。
※种子健康测定的目的和重要性主要有以下几点：
※1. 种子携带的病原物可以引起田间病害，逐步蔓延，以致降低作物产量和商品价值。
※2. 种子的流通可以将病原物携带到其他新的地区。
※3. 了解种子的种用价值，通过种子样品的健康测定，可推知种子批的健康状况，确定种子批是否需要进行处理以及处理后的效果。
※4. 为了调查或研究目的而评估种传病害流行的情况。
※5. 探明种子发芽率低的原因，弥补发芽试验的不足。
※目前随着国内外种子贸易的增加，种子携带病虫传播和蔓延的机会也随之增多，万一种子携带的病虫害传入新区，就会给农业生产造成重大的损失和灾难，因此，现在种子健康测定日益得到重视。
※当今，世界上许多国家种子检验室也开展和发展种子健康测定，以满足各国种子贸易的需要，保护农业生产和农产品质量。
二、种子健康测定方法的特点
※未经培养检查包括直接检查、吸胀种子检查、洗涤检查、剖粒检查、染色检查、比重检查和Ｘ－射线检查等。
※培养后检查包括吸水纸法、砂床法、琼脂皿法，以及噬菌体法和血清学酶联免疫吸附试验法等。
※选择种子健康的测定方法主要取决于种子种类、病害的种类以及检测的目的。如对于调查、作出种子处理决定或进行田间评定等目的，只需评定种传病菌感染率。而对于检疫目的或田间高发病率的种传病，对种子样品的检测精度则要求很高。
※由于病害感染水平与田间发病程度之间没有直接的联系，在许多检测方法中，一般不记录每粒种子的病原数量。
※种子健康测定的方法，一般要求该方法使病原体易于识别、结果有重演性、样品间结果有可比性和简单快速等特点。但在实际检测过程中，检测结果经常会受到一些因素的影响：
※1. 其他病原菌存在可能与被测病原菌产生干扰；
※2. 室内检验结果通常高于田间或温室的检测结果；
※3. 有些病原菌对培养条件敏感；
※4. 种子已经处理；
※5. 种传病原菌生活力随着长时间的贮藏而衰退。
三、种子健康的标准与处理
※种子的健康标准是健康检验的评定依据。许多国家根据各自的国情，制定了种子生产中各级种子的田间健康标准和室内检验健康标准。
※种子经过健康检测后，了解了病原菌的感染情况和程度，则可以有针对性地采取措施对种子进行处理，这样即可以大大减轻种传病害的发生，同时还可以减少农药的使用。
第二节 检测的基本方法
一、试验样品
※根据测定方法的要求，可把整个送验样品或其一部分作为试验样品。如遇特殊情况，要求送验样品大于GB/T 3543.2—1995的2.6.3所规定的数量，就要相应地通知扦样员。
※当要求把送验样品的一部分作为试样时，则应按GB/T 3543.2—1995的2.7.2所规定的方法进行分取.
※通常试验样品不得少于400粒净种子，或从送验样品分取相当重量的种子。
二、仪器设备
※种子健康测定所需的仪器设备因测定方法不同而异。
※以测定真菌为例，最基本的仪器设备包括：双目显微镜(最好是相差显微镜)、立体显微镜(放大60倍，最好带有灯)、培养箱(最好配置两根近紫外灯管)、冰箱、冷冻冰箱、高压蒸汽灭菌锅、玻璃容器(培养皿、烧杯、烧瓶、载玻片、盖玻片、漏斗等)、离心机、摇床、pH值测定仪等。
三、测定方法和程序
（一）种子健康测定的传统方法
1．未经培养的检查
※未经培养的检查不能说明病原菌的生活力。主要方法有：
※（1）直接检查。 直接检查适用于较大的病原体或杂质外表有明显症状的病害，如麦角、线虫瘿、虫瘿、黑穗病孢子、螨类等。必要时，可应用双目显微镜、剖粒和软X射线仪等对试样进行检查，取出病原体或病粒，称其重量或计算其粒数。
※（2）吸胀种子检查。吸胀种子检查为使子实体、病症或害虫更容易观察到或促进孢子释放，把试验样品浸入水中或其他液体中，种子吸胀后检查其表面或内部，最好用双目显微镜进行观察。
※（3）洗涤物检查。把试验样品浸在加过湿润剂的水里或酒精里，用力振荡，把混在种子里的或附在种子上的真菌孢子、菌丝和线虫等冲洗下来。然后把洗涤液进行过滤、浓缩或者蒸发，除去过剩的液体，并用显微镜进行检查提取物。
2．生长植株的检查
※将种子培育成植株，然后检查其病症，这是测定样品中是否存在细菌、真菌或病毒等最切实可行的方法。可从供检的样品中取得接种体，以供对健康幼苗或植株一部分进行感染试验。严格各种条件，必须防止植株从别处来的次生感染。
（二）真菌检测方法
※1、吸水纸法
※吸水纸法适用于许多类型种子的种传真菌病害的检验，尤其是对于许多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的症状的发展。为了促进孢子形成，建议在培养期间给以12小时黑暗与12小时近紫外光(NUV)的交替处理。建议光源使用“黑光”荧光灯(峰值为360nm)，不过日光荧光灯管效果也不错。
※操作程序为：
※①在培养皿中放入三层吸水纸，用无菌蒸馏水湿润，沥去多余水分；
※②把种子播在纸上，盖好培养皿；10×20
※③放在20℃条件下让种子吸胀一天；
※④在-20℃下冷冻过夜，杀死种子；
※⑤在18～20℃和每天12小时黑暗与12小时近紫外光灯光照交替处理下培养（培养的时间视所培养的真菌种类而定，一般为5～7d），培养皿距光源40cm处。
※⑥在立体显微镜下观察，观察时用冷光，以防止孢子结构脱水。
※2、琼脂皿法
※ 主要用于发育较慢的致病真菌潜伏在种子内部的病原菌，也可用于检验种子外表的病原菌。
※琼脂皿法的测定程序为：①先将试验样品用1％～2％的次氯酸钠溶液消毒5min后沥干；②把已经灭菌的琼脂到入9cm培养皿中，待其凝固并冷却后，把预处理过的种子间隔排列于琼脂表面，在20℃黑暗条件下进行培养（一般需7d以上）；③用肉眼检查每粒种子外部长成的典型菌落。对有怀疑的菌落，可将长有该菌落的琼脂块（约5mm2）切出，用吸水纸法在20℃下进行培养，诱导孢子发育后在显微镜下进行鉴定。
※３、发芽法
※可以通过发芽法比较未处理种子的病原体作用和影响，其测定程序为：
※①取一张纸巾，底部皱折1cm，在无菌蒸馏水中浸湿；
※②将种子播在纸巾上；
※③将另一张浸湿的纸盖在种子上，与播有种子的纸巾皱折吻合，用橡皮筋捆好；
※④将纸卷放在器皿中在20℃ 下培养；
※⑤观察感病幼苗异常情况，根部变褐部分；
※⑥与琼脂皿培养的鉴定结果比较。
四、细菌测定方法
※１、生长植株鉴定
※最简单的方法是种植有种传细菌的种子，鉴定幼苗的症状。
※２、检验室方法
※检验室测定细菌的方法程序：
※①病原体提取。提取方法主要有通过浸泡种子，或通过磨碎或破碎种子并在液体中浸湿等两种方法。种子数量和方法应根据试验确定；
※②分离。通过琼脂皿可以将病原细菌从提取后的溶液中分离出来，将提取液原液或者稀释液涂在琼脂皿上，可分生出单个或者许多菌落；
※③细菌鉴定。细菌检测可用下列方法：生物化学检测法；血清检测；噬菌体检测；致病体检测；核酸杂交探针法。
五、病毒测定方法
※种传病毒的检测也可以与细菌检测一样，利用田间种植鉴定和室内检测。田间种植鉴定将样品种子播种后，观察幼苗的症状。也可以从种子或幼苗中的提取液接种至“指示植物”上，更易观察和鉴定症状。
※在试验室中，由于种传病毒检测目前还存在着不易被分离出纯系的问题，而细菌与真菌的方法也不适用于病毒检测，检测种传病毒的难度很大。随着血清学和免疫学技术的发展，检验室内能够检测许多重要的种传病害，常用的方法有：酶联免疫吸附法、免疫吸附电镜技术和多克隆抗体或非常专一的单克隆抗体技术。
※随着分子生物学技术的发展，通过序列分析使得检测任何病原菌成为可能，利用PCR的分子检测技术有望成为未来快速而准确的种传病毒检测方法。
六、结果表示与报告
※以供检样品感染种子数的百分率或样品重量中病原体的数目表示结果。
※把结果填报在种子检验报告“其他项目测定”栏目内，要写明病原菌的拉丁学名。填报结果必须同时说明所用的测定方法，包括所用的预措方法和用于检验的样品或部分样品的数量。
第三节 主要病虫害的特定检测方法
※ISTA制定了许多具体种传病害测定的工作卡。其中方法非常详细，而且有各种方法的评述以及详细的参考资料。