国家重点基础发展规划项目
课题结题总结报告
项目编号：G1998010200
项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
首席科学家：贾继增 张启发
课题编号：G1998010207
课题名称：水稻抗病基因克隆
课题负责人：翟文学
子课题负责人：翟文学 彭开蔓（王石平）
承 担 单 位：中国科学院遗传所，华中农业大学
电子信箱：wxzhai@genetics.ac.cn,
swang@mail.hzau.edu.cn
20##年9月30日
一、计划任务完成情况
本课题的预期目标是分离克隆2个水稻抗病基因。我们已经按计划开展了研究工作，分别对水稻抗白叶枯病基因Xa3、Xa4、xa5、xa13、Xa25(t)和Xa26以及抗稻瘟病相关基因进行了克隆研究。目前已克隆并证实了Xa26基因；已克隆Xa4和xa5基因，即将证实其功能；精细定位了Xa3、xa13和Xa25(t)基因；获得了3个抗稻瘟病相关基因。基本达到预期研究目标。
具体工作与取得的进展如下:
1. 精细定位了水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26
我们利用F2大群体，分别对水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26进行了遗传分析和精细遗传定位。这两个基因都位于第11号染色体的长臂末端并紧密连锁。涉及Xa4基因（Sun et al., 2003, Theor. Appl. Genet. 106:683-687）和Xa26基因（Yang et al., 2003, Theor. Appl. Genet. 106:1467-1472）遗传分析的工作已发表。
2. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa26
我们采用图位克隆法从水稻品种明恢63中分离克隆了Xa26基因（专利申请号：02139212.9）。序列分析发现这该基因编码LRR受体激酶类蛋白质。研究还发现，无论是在苗期还是成株期携带Xa26基因的转基因水稻的抗谱比Xa26基因的供体水稻品种（明恢63）的抗谱显著增宽，抗性明显增强，说明遗传背景可能影响抗病主效基因的作用。分离克隆Xa26基因的工作正在发表印刷之中（Sun et al., 2003, Plant J., in press）。另外，研究还发现携带抗白叶枯病基因Xa3的近等基因系IRBB3和携带抗白叶枯病基因Xa22(t)的云南地方稻品种扎昌龙也携带Xa26基因。因为Xa3和Xa22(t)基因也被他人定位于第11号染色体长臂末端，推测Xa26、Xa3和Xa22(t)是同一个基因，这部分验证工作正在进行之中。
3. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa4
我们采用图位克隆法从水稻近等基因系IRBB4中分离克隆了Xa4基因（专利申请号：02139257.9）。序列分析发现这该基因也编码LRR受体激酶类蛋白质。Xa4和Xa26属于同一个基因家族的不同成员。抗性分析发现发现籼稻品种特青和93-11与IRBB4的抗谱相同，序列分析发现特青和93-11也携带Xa4基因。转基因初步实验结果显示遗传背景可能也影响Xa4基因的抗性。目前，这部分工作正在完善之中。
4. 分析了Xa4和Xa26所属基因家族的进化
Xa4和Xa26基因所属家族（命名：Xa26基因家族）包括10个成员。我们对水稻品种明恢63和特青包含Xa26基因家族的大约100 kb区段进行了测序，对比公共数据库中的水稻品种日本晴和93-11的同源区段的序列，分析了抗病基因的进化模式。涉及这部分工作的论文正在撰写之中。
5. 鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因Xa25(t)
在杂交水稻恢复系明恢63中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因Xa25(t)。该基因在苗期和成株期都能特异性的抗白叶枯病菌生理小种PXO339。通过分析携带Xa25(t)基因的重组自交系群体，将该基因定位于水稻第12号染色体的着丝粒区。在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因，推测Xa25(t)基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。涉及Xa25(t)基因的研究工作已发表（Chen et al., 2002, Phytopathology 92:750-754）。
6. 构建了水稻全生育期平衡化cDNA文库
利用水稻品种明恢63，构建了全生育期平衡化cDNA文库。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的15种不同组织的cDNA组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。该文库包含大约62,000个克隆，平均插入片段为1.4 kb （Chu et al., 2003, Chinese Science Bulletin 48:229-235）。对该文库中的大约4万个cDNA克隆进行了测序， 获得两万多个非重复EST序列。利用该文库我们建立了高效cDNA芯片（包括cDNA array和cDNA microarray）分析体系。
7. 发展了一种新的EST聚类方法
我们发展了一种新的计算机分析方法，用于分析大规模EST测序中所产生的大量数据，以获得高质量、非重复表达序列。该方法在聚类过程中采用MEGABLAST工具对一致序列进行序列同源比较，并用phrap程序对每一EST簇进行拼接检验。这一聚类策略能降低测序错误带来的影响，有效识别基因家族成员，并避免选择性剪接的干扰。与NCBI（National Center for Biotechnology Information）的UniGene clustering方法相比，ESTClustering的聚类结果可以更好地反映表达序列的多样性。涉及这部分工作的论文已经发表（张利达等，2003,遗传学报30:147-153）。
8. 克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列
利用植物NBS－LRR类抗性基因的高度保守区设计PCR引物从水稻基因组中扩增同源序列，经克隆测序确定后获得了23个不同的NBS片段（称为抗性基因同源序列，简记为RS）。将这些RS序列在窄叶青/京系17 的重组自交系（RIL）构建的分子图谱上定位，定位结果表明它们分布在1，3，4，7，8，9，10 和11染色体。其中10个RS位于已知R基因所在的染色体区间。这些RS标记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。有关结果已发表（Zheng et al，2001,CIENCE IN CHINA (Series C), 44(3): 253-262）。
9．构建了含Xa4、xa5和xa13三个抗性基因的IRBB56基因组BAC文库
利用含Xa4、xa5和xa13三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含55296个克隆，平均插入片段为132 kb。按水稻基因组为450 Mb计，该文库覆盖14倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.99％。用均匀分布的3个叶绿体基因和4个线粒体基因克隆作探针筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于1％。用分布于水稻3条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNA标记筛选文库，分别检测出11--106个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆（王文明等，2001，遗传学报, 28(2)：120－128；Wang et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics, 265: 118-125）。本研究中建立的提取高质量水稻基因组DNA方法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序(Science, 2002,296: 79-92)。
10、克隆了一个NBS-LRR类抗性基因家族
用水稻抗白叶枯病基因Xa4的近等基因系和基因累加系对克隆的NBS-LRR同源序列RS13进行RFLP分析，发现序列RS13来自Xa4基因位点（Wang et al, 2000, Chinese Science Bulletin, 45(19): 1779-1782）。利用克隆的抗病同源序列RS13作为探针，从水稻IR64的BAC文库中筛选到4个阳性克隆，其中一个克隆14E19能够覆盖其余3个克隆。对14E19进行了全序列测定和分析，获得了73kb的全长DNA序列，基因预测显示其上有4个编码NBS-LRR的基因，分别命名为NL-A－D。同时,对近等基因系IRBB56同一基因组位置的BAC克隆106P13进行分析，发现其上有10个NL同源拷贝，其中有4个同14E19上的NL一样，说明NL是一个至少有10个成员（分别命名为NL-A—NL-J）的基因家族。搜索日本晴、93-11、广陆矮4号的序列，发现三者也有多个高度同源的序列。对NL基因进行RT-PCR和cDNA库筛选分析，发现NL-B能够在含抗白叶枯病基因Xa4水稻品系IRBB4中特异表达，说明NL-B参与了白叶枯病抗性反应。把这些同源拷贝作为新的抗病基因进行研究，转基因实验正在证实这些同源拷贝的功能。
11、定位克隆了隐性抗白叶枯病基因xa5的候选基因
本研究利用RFLP、CAPS等标记方法对xa5近等基因系IR24和IRBB5构建的F2群体共5000个单株进行群体连锁分析，构建了xa5的精细遗传图谱。在此基础上我们用 与xa5基因紧密连锁的标记筛查含有xa5 的水稻累加系IRBB56的BAC文库，构建了包含xa5基因位点的精细物理图谱（Zhong et al, Chinese Science Bulletin, in press）。将xa5限定在12kb的片段上，在此区间发现唯一一个候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因与显性等位基因编码的氨基酸序列有差异。目前功能互补实验已获得转基因植株。
12．开展了抗白叶枯病基因Xa3和xa13的精细定位与图位克隆
本研究利用IR24与含Xa3基因的近等基因系IRBB3组合构建了约2000单株的F2定位群体，并利用国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组计划所公布的第11染色体长臂上的序列设计出一系列SSLP和CAPS标记，对Xa3进行精细定位，将Xa3基因定位于CAPS标记Y3和SSR标记RM144之间，距Y3约0.25cM，距RM144约1.0cM。目前，我们又利用日本晴和IRBB3组合构建了约5000单株的F2群体，对Xa3基因作进一步精细定位。
利用xa13的近等基因系构建了包含4000单株的F2群体，将xa13基因界定在第8染色体80Kb的区间。对这个区间进行DNA测序和基因预测，发现了可能的候选基因，正对这些候选基因进行共分离分析和功能互补分析，有望获得突破。
13、分离克隆了抗稻瘟病相关基因
本研究利用cDNA-AFLP和组池分离分析(BSA)相结合的方法来检测稻瘟病抗池和感池中特异表达的基因。在大约20122个检测到的位点中，一共获得了12个差异表达的条带(DEBs)，8个来自抗池，4个来自感池。利用水稻的DH群体对它们进行遗传定位结果表明其中的5个DEBs，R1, R8, S9, S16和S17被定位在第一染色体的一个抗稻瘟病的QTL所在的区间。 序列分析和等位分析发现R1和S16， R8和S9分别来自二对等位基因位点，而且R1(S16)， S17和R8(S9)分别位于第一染色体上三个紧密相连的BAC/PAC克隆中，这更进一步证实了R1(S16)， S17和R8(S9)在第一染色体上QTL包含区间中的紧密连锁关系。逆向Northern Blotting和定量RT-PCR分析表明R1(S16)， S17和R8(S9)在接种稻瘟病菌后的表达水平都是上调的，这暗示它们都参与了稻瘟病抗性反应过程。有关结果已投送国际学术刊物。
二、研究水平与创新性
本研究是在基因的水平上发掘水稻的抗病种质，重点是克隆符合“基因对基因”假说的，以过敏性抗病反应为基础的水稻抗病基因。已克隆的多种植物的抗病基因在序列结构上分为五种类型，而迄今正式见诸于报导的克隆的水稻抗病基因只有4个，即抗白叶病基因Xa21和Xa1，抗稻瘟病基因Pib和Pi-ta。它们分属于二种不同的结构类型。这对于全面深入了解水稻抗病基因的本质还是远远不够的，而且也不能满足育种上对抗病基因的需求，而这二个方面正是本研究重点解决的科学问题。
本研究特色在于应用水稻基因组研究的遗传作图和物理作图的综合技术以及在基因组测序基础上发展起来的基因预测方法，充分利用水稻基因组较小的特征，从多种途径发现抗病和感病的水稻材料的遗传差异，克隆水稻的抗病基因。本课题克隆Xa26和Xa4等显性抗病基因补充和发展了植物抗病基因的研究结果，而且克隆的几个抗病基因均有重要的实用价值，研究结果将促进水稻抗病分子育种的发展。
虽然近年来抗病基因研究取得许多突破，但是我们也发现已克隆的植物抗病基因多为显性基因，隐性抗病基因的研究进展不大。隐性抗病基因的研究成为目前植物抗病研究的新问题。
为此我们在本课题后期启动了水稻隐性抗病基因xa5和xa13的克隆，这一研究具有很高的创新性。目前已将xa5限定在12kb的片段上，在此区间发现并分离出一个编码转录因子的候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因一旦证实，将成为植物抗病基因研究的重要突破。对隐性抗病基因进行克隆和研究，有助于全面解析植物的抗病机制以及抗病新思路的提出。
通过五年的工作，本课题建立了较好的工作基础，取得了一些成果和一些有望突破的阶段结果。基本接近国际同类研究水平。
三、实施效果
粮食增产的关键在于优良品种的培育，抗病育种是植物育种的一个重要方面。鉴定和分离抗病基因，通过基因工程的手段培育抗病品种具有广阔的应用前景。近年来已经克隆了几十个抗病基因，然而具有重要利用价值的抗病基因不多。本课题克隆具有重要应用价值的水稻抗病基因，为我国水稻抗病育种提供基因资源和技术资源；同时利用研究结果与建立的技术促进植物抗病基因研究及其相关学科的发展。五年的课题实施已出现良好效果。
本课题抗病基因克隆中建立的分子标记已成功地用于水稻分子育种。例如：四川农业大学水稻研究所李世贵教授研究组，利用本研究中建立的分子标记进行辅助选择培育出聚合多个抗白叶枯病基因的恢复系“抗病527”，与不育系杂交已组配出优质抗病杂交水稻新组合8个，其中5个已进入20##年四川省区试。本课题已克隆抗病基因也正在通过基因工程向重要的水稻品种中转移。另外本研究中建立的提取高质量水稻基因组DNA方法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序(Science, 2002,296: 79-92)。到目前为止，本课题已发表（或接受）论文 15 篇，其中 SCI 论文 10 篇；还有一些论文在整理或投送中。这些资料对本学科的发展起到了重要作用。
四、人才培养、合作交流、数据共享等方面的情况
本课题实施过程中培养了多名科研人才，其中博士后2名，博士6名，硕士2名。许多重要工作都是有他们具体完成的。本课题积极参加各种学术交流活动，包括每年一次的项目内的学术交流以及同领域的学术会议，通过交流提高了学术水平，共享了数据，促进了工作。
五、经费使用情况
本子项目五年使用总经费为2393千元。其中从专项经费获得的资助为2077千元，主要用于研究费用。从依托单位获得的资助为316千元，主要用于支付参加人员的部分工资与房屋和仪器的部分使用费。本课题收入与支出基本平衡。
详细情况见：子项目预算执行情况表和子项目预算执行情况说明书（1998-2003）。
六、存在的主要问题和今后研究工作设想
由于本课题是国家第一批973立项课题，课题管理和财务管理都具有探索性和创新性，在不断完善的过程中，非研究工作占据了主持人的许多时间和精力。 另外后三年和前两年经费有些脱节。20##年非典也造成一些影响。这些因素延误了课题的快速进展。
进一步的研究将开展下列工作：1、对已克隆基因进行深入研究；2、完成已开展的抗病基因克隆工作；3、研究隐性抗病基因的抗病机制；4、开展其它水稻重要功能基因的克隆研究。
七、签字盖章
课题组长签字：
承担单位签字盖章：
表一 973计划项目结题基本信息表
项目编号：G1998010200
表二 973计划项目投入统计表
项目编号：G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
注：① 包括课题负责人。
② 将本项目的参加人员分为A、B、C三类分别进行总计， A是以职称为统计口径的项目参加人员之和，C是以年龄为统计口径的项目参加人员之和，其中A=C。
表三 973计划项目产出统计表（1）
项目编号：G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
①博士后、博士、硕士指统计时间内出站或毕业的人数；优秀中青年人才指统计时间内获得的人次，其中包括：杰出青年基金、中科院百人计划、长江学者计划。
表三 973计划项目产出统计表（2）
项目编号：G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
注：①其它奖需填奖项名称
表四 973计划项目发表论文目录
项目编号：G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
注: ①在类别栏中注明：S、E、G、Q，S——SCI，E——EI，G——国内核心刊物，Q——其它；
②责任作者指第一作者或通讯作者
③单位指论文标出的单位，应同时标出排序，如A大学排名第2，应填写A大学（2）。如有多个单位，只列出排序靠前的一个单位
附件2
表五 973计划项目发明专利目录
项目编号：G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究
注：①只填写与本项目有关的发明人，并在括号中注明排名第几，如张明（3）。
表六 973计划项目特邀报告目录
项目编号： 项目名称：
注：①注明国际或国内会议