430139生物工程（Biotechnology Engineering）
全日制工程硕士专业学位
研究生培养方案
培养单位： 生命科学学院(204)
药学院(306)
一、培养目标
培养掌握生物工程领域坚实的基础理论和宽广的专业知识，具有较强的解决实际问题的能力，能够独立承担专业技术或管理工作，具有良好的职业素养的高层次应用型专门人才，具体要求为：
1.拥护党的基本路线和方针政策，热爱祖国，遵纪守法，具有良好的职业道德和敬业精神，具有科学严谨和求真务实的学习态度和工作作风，身心健康。
2.掌握本领域的基础理论、先进技术方法和手段，在领域的某一方向具有独立从事工程设计、工程实施，工程研究、工程开发、工程管理等能力。
3.掌握一门外国语。
二、领域简介
主要涵盖：植物生物技术、动物生物技术、生物技术医药、生态技术、发酵工程、基因工程、蛋白质工程、细胞工程、生化工程等。
三、招生对象与学习年限
具有国民教育序列大学本科学历 ( 或本科同等学力 ) 人员。
采用全日制学习方式，学习年限一般为2年。
四、培养方式
采用课程学习、实践教学和学位论文相结合的培养方式。
课程设置体现厚基础理论、重实际应用、博前沿知识，着重突出专业实践类课程和工程实践类课程。实践教学是全日制工程硕士研究生培养中的重要环节，鼓励工程硕士研究生到企业实习，可采用集中实践与分段实践相结合的方式。工程硕士研究生在学期间，必须保证不少于半年的实践教学，应届本科毕业生的实践教学时间原则上不少于1年。
五、课程设置
攻读本领域工程硕士学位的研究生，应获得总学分不少于34学分：
（一）学位课程不低于20学分，包括公共课10学分、专业必修课10学分；
（二）选修课程不低于8学分；
（三）专业实践6学分。
另外，须完成开题报告、论文中期报告两个必修环节。具体课程设置及学分要求见附表。
六、实践环节
在学期间必须保证不少于半年的专业实践，可采用集中实践与分段实践相结合的方式。可在学院已建立的联合培养基地进行实践，也可以结合工程项目到用户单位实践。根据工程项目的要求，需要在本校实践的研究生，需由导师提出书面申请，学院审核批准，并报研究生院审查备案。
研究生须在第1学期期末确定论文导师后，在导师指导下制定并提交实践计划；专业实践一般应安排在第2、3学期期间，并按预先计划的方案逐步完成；每个专业实践环节完成后，研究生须做自我鉴定，并由指导该环节的指导人（可以是校内外导师、也可以是实践部门的专家）作出评定；专业实践完成后，研究生须撰写实践总结报告。研究生一般应结合专业实践确定学位论文的选题。实践表现、总结报告经导师组成的评定小组评审通过后，研究生可获得相应的学分，方可申请进行学位论文答辩。
《武汉大学专业学位研究生实践手册》是研究生院专门制定的重要材料，专业学位研究生每人一册，用以实时并详细记载其专业实践各环节的实施情况与评定，请务必在完成后连同实践总结报告一起存入研究生的学位档案。
七、学位论文
论文选题应来源于工程实际或具有明确的工程技术背景，可以是新技术、新工艺、新设备、新材料、新产品的研制与开发。论文的内容可以是：工程设计与研究、技术研究或技术改造方案研究、工程软件或应用软件开发、工程管理等。
论文工作须在导师指导下独立完成。实行双导师制，其中一位导师来自校内，另一位导师为来自企业与本领域相关的专家。
论文撰写完成后除经导师写出详细的评阅意见外，还应有2位（其中至少一位来自校外）本领域或相近领域的专家评阅。论文评审应重点审核：论文作者综合运用科学理论、方法和技术手段解决工程技术问题的能力；论文工作的技术难度和工作量；其解决工程技术问题的新思想、新方法和新进展；其新工艺、新技术和新设计的先进性和实用性；其创造的经济效益和社会效益等方面。
攻读全日制工程硕士研究生完成培养方案中规定的所有环节，获得规定的学分，成绩合格，方可申请论文答辩。答辩委员会应由5位（其中至少一位来自校外）与本领域相关的专家组成。
通过论文答辩者，经校学位评定委员会审核通过，可授予工程硕士专业学位，同时获得硕士研究生毕业证书。
第二篇：中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol25 No9 20xx
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(9):84~88
长白山药用真菌树舌凝集素的纯化及生化特性*
张春玉黄国辉林景卫孙非许守民刘立侠**
（东北师范大学生命科学学院长春130024）
摘要用硫酸铵分级沉淀、离子交换和HPLC层析等方法，从长白山药用真菌树舌的菌丝体中分离纯化了一种凝集素（Ganoderma applanatum lectin，简称GAL），SDSPAGE检测其为单一蛋白条带。经过SDS-PAGE测得其亚基分子量为15kDa左右，HPLC分析分子量为58kDa左右，表明GAL由4个亚基组成。氨基酸组成分析表明，GAL中甘氨酸含量较高，不含蛋氨酸和色氨酸，中性糖含量约11.2%。圆二色CD谱显示其含有3.6%的α螺旋、46.8%的β转角和49.6%无规则卷曲，不含有β折叠。GAL可以凝集供试的2种动物血和3种血型人血的血红细胞，但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明，只有棉籽糖和D-松三糖部分抑制GAL的凝血活性。GAL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价阳离子的影响。
关键词树舌凝集素生化特性血凝集活性
收稿日期：20050627修回日期：20050805
*国家留学青年资助基金(2003),吉林省科技厅重大招标资助项目(200404013)
** 通讯作者，电子信箱：liulx062@凝集素（Lectin）是一类广泛存在于动植物和微生物中非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地结合，具有凝集血细胞的作用［1］。目前全世界大约有50多种药用真菌凝集素被纯化，其分子量为12~190kDa，含糖量为0%~18％［2］，这些凝集素能够参与和介导细胞中各种生命现象的调节，尤其是其显著的抗肿瘤作用引起了人们的广泛关注。研究表明从灵芝（Ganoderma Capense）、金针菇（Flammulina velutipes）、杨树菇（Agrocybe aegerita）和口蘑（Tricholoma mongolicum）等真菌中分离的凝集素都具有很强的抗肿瘤活性［3~6］。由此可见，凝集素是药用真菌的一种主要药理成分。
长白山区具有丰富的食用和药用真菌资源，其特产的树舌是具有较高药用价值的大型真菌。本文报道了从长白山来源的树舌菌丝体中分离出天然的凝集素成分，分析了其理化性质、血凝集活性和特点，为药用真菌树舌中生物活性物质的研究和利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
树舌菌种购自吉林农业大学菌物所；小白鼠和家兔购自吉林省生物制品所实验动物中心；正常人血由吉林大学再生医学研究所提供，收集的血配成2%的红细胞悬液。
DEAE Sephadex A25为Pharmacia产品；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris和十二烷基磺酸钠（SDS）等化学试剂购于上海生工生物技术有限公司；低分子量标准蛋白为宝泰克产品；糖抑制实验中所用的糖均为Sigma产品；实验中所用其它试剂皆为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1凝集素的分离纯化称取液体培养的树舌菌丝体60g（鲜重），加入10mmol/L TrisHCl (pH8.0)置冰箱浸泡24h，经高速捣碎机匀浆后，四层纱布过滤，滤液在3500r/min条件下离心20min，收集上清液，向其中加入固体硫酸铵达40％饱和度，低温搅拌20min置4℃
冰箱过夜。4 000r/min条件下离心30min后弃沉淀，继续向上清液中加入固体硫酸铵达90％饱和度，搅拌、放置、离心同前，最后获取的沉淀透析脱盐后得树舌凝集素（GAL）粗品。取DEAE Sephadex A25经处理后装柱（2.6cm×40cm）用NaCl液平衡，取上述GAL粗提液（浓度为3mg/ml）上柱，流速30ml/h，5ml/tube，0.1~1.6mol/L NaCl洗脱液4℃层析柜进行线性离子梯度洗脱，收集洗脱峰透析冻干后备用，并进行凝血活性检测。
1.2.2凝集素在HPLC上的纯化和检测将冻干后样品用10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)溶解，经HPLC纯化，条件为：仪器：Japan SHIMADZU LC-10AVP系统，检测器：SHIMADZU SPD－10AVP，工作站：CLASS-Vp，色谱柱：TSK-GEL，G3000PWXL，SIL-10ADVP自动进样器进样，流动相0.9%NaCl（pH8.0），流速0.5ml/min，柱温为4℃，压力为1.6 mpa, 取供试样品（浓度为2mg/ml）1 ml，045μm柱头过滤器滤过，设定20μl进样量,记录色谱图。将收集的蛋白峰和记录峰对照进行凝血活性检测，严格收集第1活性峰，透析除盐，冷冻干燥后得GAL纯品。 2005, 25(9)张春玉等：长白山药用真菌树舌凝集素的纯化及生化特性
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.9 2005
1.2.3分子量测定（1）SDSPAGE测定亚基分子量［7］，分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%，考马斯亮蓝R250染色，所用标准蛋白为兔磷酸化酶B（MW=97 400）、牛血清白蛋白（MW=66 200）、兔肌动蛋白（MW=43 000）、牛碳酸酐酶（MW=31 000）、胰蛋白酶抑制剂（MW=20100）和鸡蛋清溶菌酶（MW=14 400）。（2）HPLC法测定分子量。标准蛋白样品及条件同上,取标样（浓度为2mg/ml）和供试样品（浓度为2mg/ml）各1 ml，设定20μl进样量，记录色谱图。数据采用SHIMADZU的GPC专用软件处理，通过计算机计算出分子量。
1.2.4氨基酸组成分析吉林大学分析测试中心测试。纯化的GAL在6mol/L HCl中110℃水解18h后，Agilent1100型氨基酸自动分析仪分析氨基酸组分。
1.2.5含糖量测定苯酚-硫酸法［8］测定。
1.2.6圆二色CD谱检测J810型圆二色谱仪检测和记录。蛋白质浓度以Folin酚法［9］测定，圆二色性用平均残基椭圆值［θ］表示，单位是deg·cm2/d·mol，通过计算机计算GAL二级结构构象的单元含量。
1.2.7血凝集试验［10］在“V”型血凝板中加入25μl的生理盐水，取GAL（浓度为1mg/ml）25μl作倍比稀释，每孔加入2％的血球悬液。摇动血凝板使溶液混匀，血凝板在室温放置
1.5~2h，显微镜下检测观察结果，血凝滴度以2n（n为使血球凝集的最末孔数）表示。
1.2.8糖抑制试验方法同血凝试验。GAL作倍比稀释，各孔加入80mmol/L的糖溶液，摇动血凝板使溶液混匀，室温放置1.5~2h，显微镜下检测观察结果。
1.2.9温度稳定性取1mg/ml GAL数份，分别在30、40、50、55、60、70℃水浴中处理10min，迅速冷却至室温，检测其对兔血红细胞的凝集活性。
1.2.10金属离子对凝血活性的影响将GAL对20mmol/L EDTANa2充分透析，透析后的溶液中分别加入10mmol/L 的CaCl2、MgCl2和ZnCl2，再检测对兔血红细胞的凝血活性的影响。 2结果与分析2.1树舌凝集素的纯化和检测
树舌凝集素的粗提液经过DEAE Sephadex A25离子交换柱（0.1mol/L1.6mol/L NaCl溶液，pH8.0）梯度洗脱后得到一个洗脱峰（图1）；收集洗脱峰再经HPLC纯化（图2），并进行凝血活性检测。结果表明，峰1量多且凝血活性较强即为树舌凝集素（GAL）纯品，峰2量少且无凝血活性；由于这两个峰的分子量很接近，在离子交换柱中难于分开，而在HPLC上则因其灵敏度高，可将两个蛋白质分开，实验中严格取用了1峰，确保了GAL的高纯度。 图1树舌凝集素在DEAE Sephadex A25柱上的
线性离子梯度洗脱
Fig.1The plot of lineargradient system for Ganoderma
applanatum lectin on DEAE Sephadex A25column
2.6cm×40cm；flow rate,30ml/h, 5ml/tube；
NaCl, phosphate buffer
上述的GAL样品经SDSPAGE检测结果见图3。
2.2树舌凝集素的分子量和亚基分子量、氨基酸组成及含糖量
树舌凝集素经HPLC纯化后，通过GPC软件在计算机上分析分子量约为58kDa左右，SDSPAGE测得其亚基分子量约为15kDa左右，表明GAL由4个亚基组成；氨基酸组分分析结果（表1）表明，GAL中甘氨酸含量较高，不含有蛋氨酸和色氨酸；苯酚－硫酸法测得GAL含有11.2％的中性糖，表明GAL是一种糖蛋白。
图2树舌凝集素的高效液相色谱图
Fig.2HPLC pattern of Ganoderma applanatum lectin
1：Activity peak； 2：Inert protein peak
图3树舌凝集素的SDS－PAGE电泳
Fig 3SDSPAGE of Ganoderma applanatum lectin
M：Standard protein； 1：Precipitation of 40%~90 %( NH4)2SO4；
2：HPLC（Crude GAL）；3：DEAE Sephadex A25
表1树舌凝集素的氨基酸组成（%）
Table1Animo acid composition of Ganoderma
applanatum lectin（%）
氨基酸〖〗含量（％）〖〗氨基酸〖〗含量（％）Asp〖〗1.34〖〗Thr〖〗0.62Glu〖〗3.11〖〗Val〖〗0.66Ser〖〗1.35〖〗Phe〖〗0.67Trp〖〗nd〖〗Ala〖〗0.83His〖〗0.67〖〗Leu〖〗1.09Gly〖〗35.5〖〗Pro〖〗0.60Ile〖〗0.56〖〗Met〖〗ndArg〖〗0.72〖〗Lys〖〗1.18nd：not determined
2.3圆二色CD谱
结果（图4）表明，GAL二级结构中含有3.6%的α螺旋和46.8%的β转角及49.6%无规则卷曲，不含β折叠。
图4树舌凝集素的CD光谱图
Fig. 4Circular dichroic spectra of Ganoderma
applanatum lectin
2.4树舌凝集素的生物学活性
2.4.1树舌凝集素的凝血活性GAL对供试的3种血型的人血及兔和小鼠的血红细胞都有凝集活性，但对人类3种血型的血红细胞的凝血活性较强，血凝滴度为28~215，对兔和小鼠的相对较弱为23~28。
2.4.2树舌凝集素的糖抑制实验从结果（表2）看出，只有棉籽糖和D-松三糖对GAL的凝血活性有部分抑制作用，单糖和二糖无抑制作用。
2.4.3树舌凝集素的热稳定性结果（表3）表明，GAL是一种对热较稳定的凝集素，当温度在55℃以下时，保持全部凝血活性，温度超过60℃时，凝集素失去大部分活性，当达到70℃时完全失活。由此可见，GAL具有较好的热稳定性。
2.4.4二价金属离子的影响GAL经过EDTA透析后，其凝血活性没有变化。在透析后的溶液中分别加入10mmol/L CaCl2、MgCl2、ZnCl2，对GAL凝血活性也没有影响，说明GAL凝血活性不受二价金属离子Ca2+、Mg2+、Zn2+的影响。
3讨论近年来，对凝集素的研究发展较快，主要集中在其生理生化特性和生物学功能方面，如在植物防病抗虫、基因工程和抗肿瘤等方面有着较为深入的研究和广泛的应用前景。本文报道的树舌凝集素是一种新的凝集表2GAL的糖抑制实验结果
Table 2Inhibition of agglutination of Ganoderma applanatum lectin by sugars Sugars〖〗Ganoderma applanatum lectin（μg/ml）1000〖〗500〖〗250〖〗125〖〗62.5〖〗31.3〖〗15.6〖〗7.80〖〗3.90〖〗1.95〖〗0.97〖〗0.48〖〗0.24DMelezitose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋Raffinose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋Maltose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－DGalactose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－LSorbose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－LArabinose〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－＋：positive agglutination；－：negative agglutination
表3温度对树舌凝集素凝血活性的影响
Table 3 The effect of temperature on the hemagglutinating activity of Ganoderma applanatum lectin
Temperature（℃）〖〗Ganoderma applanatum lectin（μg/ml）1000〖〗500〖〗250〖〗125〖〗62.5〖〗31.3〖〗15.6〖〗7.80〖〗3.90〖〗1.95〖〗0.97〖〗0.48〖〗0.2430〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋40〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋50〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋55〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋60〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗＋〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－70〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－〖〗－＋：positive agglutination；－：negative agglutination
素，与已知的几种食用菌如草菇，杨树菇和金针菇等凝集素的分子量、氨基酸组分和结构有一定的差异，但都具有相同的生理特性。实验证实，GAL的血凝集活性不能被单糖和二糖所抑制，但可以部分被三糖所抑制，由此可见GAL不与单糖和二糖结合，其糖结合特异性有待进一步研究。GAL对热较稳定，与已报道的大多数凝集素有相似之处。曾仲奎等［11］曾报道温度对凝集素所引起的RNaseT1二级结构的变化，表现出β折叠有较大破坏，而α螺旋变化较小，这与温度对树舌凝集素活性影响的实验结果基本相似，树舌凝集素中含有3.6%的α螺旋和46.8%的β转角及49.6%无规则卷曲，不含β折叠，因此温度升高对其活性变化的影响相对较小。与其它的真菌凝集素相比，GAL和真菌免疫调节蛋白有一定的相似之处，如凝血活性不能被单糖和二糖所抑制［2,12］，氨基酸组成中没有Met等。这暗示着GAL可能具有一定的免疫调节活性，如诱导不同的细胞因子产生，进而达到提高机体免疫力和抗肿瘤的功效。因此深入研究GAL的生物学活性以及免疫调节活性及机理，对药用真菌树舌的进一步开发和利用提供有价值的依据。
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Purification and Characterization of a Novel Lectin from the Medicinal
Fungus Ganoderma applanatum in Changbai Mountain
ZHANG ChunyuHUANG GuohuiLIN JingweiSUN FeiXU ShouminLIU Lixia (School of Life Sciences, Northeast Normal UniversityChangchun130024, China)
AbstractA novel lectin（GAL）from the liquid cultured mycelia of medicinal fungus Ganoderma applanatum was purified by precipitation of 40%~90 %( NH4)2SO4, followed by ion chromatography DEAE Sephadex A25 and HPLC. The purified lectin showed a single band on SDSPAGE. The relative molecular mass of GAL was about 58kDa tested by HPLC, the subunit of GAL was about 15kDa determined by SDSPAGE. This implied GAL was composed of four subunits. It contained a high content of glycin, the inexistence of methionine and tryptophan and 11.2% carbohydrates. Circular Dichroic spectra showed it contained 3.6％ αhelix, 46.8% βturn and 49.6% random without βfold. GAL could agglutinated red blood cells, while its hemagglutinating activity for different resources of red blood was different. In a hemagglutination assay, DMelezitose and Raffinose were the inhibitors of GAL
among the sugars tested. GAL was thermo-stable and metal cations such as Ca2+、Mg2+ and Zn2+had no effects on GAL.
Key wordsGanoderma applanatumLectinCharacteration of biochemistryHemagglutinating activity