白细胞计数和分类

目的：掌握血涂片制备的操作要领、瑞氏染色方法、正常外周血五种白细胞形态

特点、

原理：各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）

染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。测定外周血液中各种白细胞的相对比值，以观察其数量、形态和质量变化，通过显微镜观察染色血涂片，计算血液中各类白细胞的百分率，称为白细胞分类计数。利用白细胞总数和各类白细胞的百分率，即可计算每mm3血液中各类白细胞的绝对值。

实验器材： 香柏油、盖玻片、推片、采血针或注射器、小滴管、消毒棉球、瑞

氏染液、pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液、蒸馏水、计数板及专用盖片、针 1ml刻度移液管、1ml EP管、光学显微镜。20ul刻度移液管、推片

实验步骤

白细胞分类

1．血片制作：

取一滴血，滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉，当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。

注：（1）良好涂片标准：

１) 呈头、体、尾舌形

２) 血膜厚薄适宜

３) 两边留有空隙 （2）涂片好坏与下列因素有关： 1）血滴大小 2）推片与玻片之间角度 3）推片速度

2、血涂片的染色步骤：

（1）用蜡笔在血膜两端各划一道线，以免染料外溢，置涂片于染色架上。

（2）滴加瑞氏染液，共计七八滴数，以盖满血膜为度，静置1分钟。

（3）再滴加等量的磷酸缓冲盐溶液，轻轻摇动，并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀，静置15分钟。

（4）用清水冲洗。切勿先倾去染液再冲洗，否则沉淀物附于血膜上不宜出去。冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。

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《实验诊断学》实验报告

实验一 红细胞、白细胞计数

一. 实验原理

一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数。用稀醋酸液将血液稀释并破坏红细胞，混匀后充入计数池中，于显微镜下计数一定体积内的白细胞数。根据稀释倍数和计数的容积，换算求得每升血液中的红细胞数量以及白细胞数量。

二. 实验内容与步骤

实验材料：

显微镜、微量吸管、毛细吸管、改良Neubauer计数板、盖玻片、小试管、RBC稀释液、WBC稀释液、正常人的全血、纱布

实验步骤：

1、红细胞计数准备：

① 加稀释液，用微量吸管吸取RBC稀释液蒸馏水2.0 ml加到小试管内。 ② 取血，毛细吸管取血10 μl。

③ 用纱布擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2-3次，立即混匀。

2、白细胞计数准备：

WBC稀释液:

冰醋酸3.0 mL（破坏红细胞）

蒸馏水97.0 mL

亚甲蓝（染色）

① 小试管加WBC稀释液0.38 mL。

② 采血，微量吸管取血20 μL。

③ 擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2-3次，立即混匀。

3、充池、观察：

① 将计数板及盖玻片檫净，将盖玻片覆盖在计数板上。

② 用滴管吸取混均的红细胞悬液充入上方计数室，静置3-5 min，高倍镜

下计数；白细胞悬液充入下方计数室，静置2-3 min，低倍镜下计数。

③ 观察计数，红细胞，高倍镜下计数中央大方格内四角的4个中方格和正中的1个中方格的红细胞，压线细胞的计数按照数上不数下，数左不数右的原则。计数时按照弓形的计数方式，以免漏数或多数。

④ 用低倍镜计数出计数池内四角大方格中的白细胞总数。

三. 实验结果

1、红细胞计数实验结果：

5个中方格内RBC的计数／个=24+27+32+22+25

根据计算公式：

RBC/L＝5个中方格内RBC数×5×10×200×106

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一. 实验原理

用等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充入计数池后，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。

二. 实验内容与步骤

   1、红细胞计数

  （1）器材：显微镜、微量吸管、改良Neubauer计数板

  （2）试剂：RBC稀释液 ①Hayem 稀释液：NaCl, Na2SO4，HgCl2 ②枸橼酸钠甲醛盐水溶液:枸橼酸钠，甲醛，NaCl ③生理盐水或含1%甲醛的生理盐水：仅在急诊或无上述两种稀释液时临时使用

  （3）标本：外周血或抗凝血（EDTA抗凝)

  （4）操作步骤：①小试管加RBC稀释液2.0 ml。

                 ②采血，取血10 μl。

                 ③擦去管外的血，轻吹入试管底部，再清洗吸管2~3次，立

                   即混匀。

                 ④混匀后充入计数室，静置3~5 min，高倍镜下计数（用高

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白细胞分类计数

[定义] 白细胞分类计数是将血液制成分布均匀的薄膜涂片，用染料染色，根据各类白细胞着色特征，在显微镜下观察其数量、形态和质量的变化、予以分类计数并求出各种白细胞所占的百分率。

[意义]血液中的白细胞一般包括：颗粒细胞（嗜中性、嗜酸性和碱性细胞）、淋巴细胞（大、中、小淋巴细胞）和单核细胞，它们分工不同，在体内发挥各自的作用。①嗜中性白细胞，成熟的嗜中性白细胞通过吞噬作用而消灭入侵的细菌，特别是球菌。在严重感染和炎症初期时最活跃；②嗜酸性白细胞，常积聚在抗原-抗体反应的部位，因此，认为它抑制组胺等物质的活动；③嗜碱性白细胞，碱性颗粒中有肝素，表明它有抗凝作用；④淋巴细胞；参与机体免疫反应；⑤单核细胞；它有特殊的酶系统，能对付顽强的病原体，如真菌、原生动物、结核杆菌及布病等。在慢性感染时或体内有较多组织碎片需要清除时，它会大量出现。 在正常情况下，白细胞构成的比例、形态和质量基本是不变的，但在病理情况下，这种比例、形态、质量将会发生变化，故临床上常把计数白细胞总数和分类计数结合起来，进行分析和诊断某些感染性疾病的种类。

[目的与要求]掌握计数的原理、方法和临床意义

[原理]由于白细胞内含有带不同电荷的物质，其中带正电荷的物质易与酸性染料结合呈现红色（这种物质叫嗜酸性物质或颗粒，而其本身呈碱性）；而带负电荷的物质易与碱性染料结合呈现蓝色（这种物质叫嗜碱性物质或颗粒，而其本身呈酸性）；当细胞内物质带的正负电荷相等时，那么结合的酸性染料和碱性染料几乎相等，这些物质就呈现红、蓝相混的紫红色（这种物质叫嗜中性物质或颗粒）。这样血片中的白细胞经过染色后就被染成红、蓝及紫红色，从而可以识别分类。

试剂：染液、缓冲液

[步骤]

1．采血

2．制作血涂片：①取洁净载玻片数张，选择边缘光滑的载片作为推片（也可用血细胞计数板的盖玻片做为推片），用左手的拇指及中指夹持载片并置于平稳的台面上，右手持推片。 ②取被检血（经EDTA抗凝）1小滴，放于载玻片的右端，手持推片放于血滴之前并与载片接触，以30°～40°角向后拉动推片，使之与血滴接触，待血液扩散形成一条线状之后，以均等的速度轻轻向前推动推片，则血液就被均匀地涂于载片上而形成一薄血膜。良好的血片，血液应分布均匀，厚度要适当，对光观察时呈霓红色，血膜应位于玻片中央，两端留有空隙，以

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实验诊断学试验操作报告

目录

一、   红细胞计数试验

二、   血红蛋白测定

三、   白细胞计数

四、   白细胞分类计数

五、   尿比重

六、   尿沉渣定性检查

七、   尿蛋白检查磺基水杨酸法

八、   尿干化学分析

九、   尿葡萄糖定性检查（班氏法）

十、   ABO血型测定

红细胞计数试验

实验目的：    通过红细胞计数实验

1、掌握红细胞计数方原理、方法及注意事项。

2、掌握血细胞计数板的结构

试验器材：    血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、血红蛋白吸管、

生理盐水

实验原理：   一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中显微镜下计数一定容积内的细胞，再换算成每升标本的细胞数报告。

操作步骤：   1、取红细胞稀释液2.0ml毫升，放入一小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血至l0ul处。

     3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，

上清液嗽洗吸管2-3次，立即摇匀。

   4、将计数池与盖玻片用软布料擦净，将盖玻片覆盖于计数池上。

5、用吸管吸取混匀的红细胞悬液，充入计数池中。

 6、待2—3分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低

倍镜观察，如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。

红细胞计数的区域：   中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。

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白细胞分类计数标准操作程序

一.目的：规范白细胞手工分类标准操作

二.适用范围：适用于镜下白细胞分类

三.支持性文件：全国临床检验操作规程第三版

四.原理：血涂片瑞氏染色分类法

五.仪器：OLYMPUS显微镜

六.试剂：瑞氏—姬姆萨复合染色液

I液：取瑞氏染粉1g、姬姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加少量甲醇(分析纯)，研磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3min，共5天，以后存放一周即能使用。

Ⅱ液：pH6．4—6．8磷酸盐缓冲液，磷酸二氢钾(无水) 6．64g，磷酸氢二钠(无水) 2．56g， 加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。

七.样本要求：静脉采血使用EDTA-K2抗凝。毛细血管采血应擦去第一滴血，以免混入组织液影响结果。

八.操作步骤：

1．采血后推制厚薄适宜的血膜片，血膜应呈舌状，头、体、尾清晰可分。

2．推好的血膜在空气中晃动，以促使快干。天气寒冷或潮湿时，应于37C温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。

3．染 色

(1)瑞氏—姬姆萨染色法：平置玻片于染色架上，滴加染液3～5滴，使其迅速盖满血膜，约lmin后，滴加缓冲液5～10滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混和，5～lOmin后用水冲去染液，待干。

4、先在低倍镜下浏览全片，了解染色的好坏和细胞分布情况，观测有无异常细胞。

5．选择涂片的体尾交界处染色良好的区域，在油镜下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数，求出各类细胞所占比值 (百分率)。

6.结果输入上海新和中文操作系统打印报告。

九.参考范围： 见表l—l—1。

表1—1—1 白细胞分类计数参考值

细胞类别 成人

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白细胞分类计数

一、血片制作：

（1）良好涂片标准：

１) 呈头、体、尾舌形

２) 血膜厚薄适宜

３) 两边留有空隙

二、染色

（1）染色方法：

1、在新鲜干燥玻片上，加瑞氏一液半滴管（以可以覆盖血膜为准），放置10ｓ后，再加缓冲液1-2滴管（以可以覆盖染液为准），轻轻吹匀，染色20min。

2、流水冲洗后，将背景擦干净，待干，镜检。

（2）染色结果判断：

1）正常：外观呈粉红色；镜下红细胞染粉红色，可见有碟状感白细胞浆中的颗粒能显

示各种细胞的特有色彩；核染紫红色，染色质清楚，粗细松紧可辨。

2）偏酸：红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅兰色或不着色。太酸则只见一片红染，白细胞除嗜酸性颗粒外，均不着色。

3）偏碱：细胞呈灰兰色，白细胞颗粒深暗，嗜酸性颗粒变成暗褐色，甚至黑色。中性颗粒也偏粗偏碱（紫黑色），血片过厚的地方呈绿色。

三、分类方法：

（1）低倍镜观察：选择细胞分布均匀、染色好的部位 转油镜下计数100～200 个白细胞,求出各种白细胞所占百分比。

（2）细胞分布:

头体部以淋巴细胞较多

尾部和两侧以中性粒、单核细胞较多,片尾部,异常、大的细胞较

多

一般选择片头至片尾的2/3 区域计数较好,即体尾交界处,按一定方式,有规律的移动视野。

【注意事项】

（1）未干透血膜，染色时易脱落，故血膜应干透再染色。

（2）冲洗前，先在低倍镜下观察有核细胞是否着色，否则适当延长染色时间 。

（3）染液不能过少，以防 蒸发，染料沉着在血膜上不易冲掉，影响观察。

（4）以流水冲去染液，防染料沉着。

（5）染色应注意保存血片尾部，不能用蜡笔划去，因体积大的细胞常在此出现。

（6）有时病人白细胞极少（一张片<100 个WBC），可数50个细胞，再算出百分数，同时应注明，或数2 张片子，并注明。

（7）发现幼稚或异常白细胞，应分类报告，包括在分类百分率中。

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