实验三 培养基的制备及玻璃器皿的包扎灭菌

【目的要求】

1、掌握培养基的制备方法。

2、掌握高压蒸气灭菌技术。

3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。

【材料和用品】

1、溶液或试剂

10%HCl、10%NaOH、营养琼脂、蒸馏水、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。

2、仪器或其他用具

pH试纸、培养基分装器、高压蒸气灭菌锅、玻璃棒、天平、牛角匙、记号笔、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、量简纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）。

【实验内容与方法】

（一）培养基的配置

1、营养琼脂培养基的配制

其配方法如下：按比例配方配制营养琼脂培养基。

（1）称量和溶解

按培养基配方逐一称取营养琼脂粉加入烧杯中，再加定量无菌水，用玻棒搅匀，加热溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。注意：在加热融化时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。

（2）调节pH

用精密pH试纸测培养基的pH，按pH的要求用质量浓度100g/L NaOH或体积百分数10%HCl调整至所需pH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测试其pH值。

（3）补水至刻度

（4）过滤

趁热用纱布过滤即可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。

（5）分装、包扎

玻棒引流于锥形瓶内，塞上棉塞，用报纸包扎。

注意：在玻棒引流时，避免瓶口沾上培养基而引起杂菌感染

2、高压蒸气灭菌的操作过程

（1）加水

立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。

（2）装锅

把需灭菌的器物放入锅内（请注意：器物不要装得太满，否则灭菌不彻底），加盖时将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。关严锅盖（对角式均匀拧紧螺旋）。

（3）加热

用电源或煤气加热，同时打开排气阀，使水沸腾以排出锅内的冷空气。待冷空气完全排出后关上排气阀。让锅内温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

（4）中断热源

达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到0时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，内外压力不平衡而翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又玷污了棉塞）。

（5）揭开锅盖，

取出器物，排掉锅内剩余水。灭菌需待培养基冷却后置于37 度恒温箱内培养24小时，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。

（二）玻璃器皿的包扎

1.洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。

2.包装

（1）移液管包装

将干燥的移液管的吸端用细铁丝塞入少许棉花构成1～1.5cm长的棉塞，以防细菌吸入

口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。包好的多个移液管可再用一张大的报纸包好。

（2）试管和三角瓶等的包装

用棉塞或泡沫塑料塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住然后在棉塞与管口和瓶口的外面用两层报纸与细线（或用铝箔）包扎好，放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。

（3）培养皿的包装

培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将每套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外）包好。如果将培养皿放金属筒内进行干热灭菌，则不必用纸包。

空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。

3、灭菌——干热灭菌法

培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160度后维持2小时，把恒温箱的调节旋扭调回零处，待温度降到50度左右，才可将物品取出。

请注意：灭菌时温度不得超过170度，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌。

4、灭菌约需1小时，期间大家可以去吃饭或者休息。灭完菌后，趁培养基冷却凝固之前分装到培养皿中，盖上盖子，让培养基冷却凝固。每组拿着培养皿选取校园某一个地点，测量空气中微生物的含量。具体操作方法如下：打开培养皿的盖子，在空气中暴露5分钟，盖上盖子，放到恒温培养箱中培养24小时。24小时后来观察结果。

【实验报告】

按实验目的的要求完成实验内容和实验报告，报告要求：

1. 简述如何制备培养基

2. 写出玻璃器皿包扎灭菌的注意事项。

【实验结果讨论】

1.培养基根据什么原理配制成？肉膏蛋白胨琼脂培养基中不同成分各起什么作用？

2.在制备培养基的过程中应注意些什么问题？

3.说明选择的测量地点是哪里，必要时画图说明。各组数出培养基上菌落的个数，在实验报告中写清楚。

第二篇：实验四 培养基的制备和灭菌

实验四 培养基的制备和灭菌一、 目的要求1、 了解并掌握培养基的配制、分装方法2、 掌握各种实验室灭菌方法及技术二、 基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。三、 器材1、 溶液或试剂 蛋白胨、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4等等见培养基配方。2、 仪器或其他用具 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、酒精灯、电炉等。四、 操作步骤基本流程：称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。1、 称量药品根据培养基配方及配制量依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2、溶解 用量筒取一定量(约占总量的2/3)蒸馏水倒入烧杯中，在电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。3、调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。4、溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。5、分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的2/3为宜。6、包扎标记 培养基分装后加好硅胶塞或试管帽。在在瓶壁或管

壁上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。7、灭菌　　培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃ 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜。　　7.1高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌　　7.2操作方法和注意事项如下 :7.2.1 加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 7.2.2 装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 7.2.3 排气 　　打开排气口(也叫放气阀)。分别设定所需灭菌温度和时间（锅体上的定时器为一压控开关）。接通电源加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 7.2.4 升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，灭菌锅自动控制加热开关以维持恒温，待设定时间到达（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，自动停止加热，待压力降至接近"0"时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。8、无菌检查　　将已灭菌培养基放入37℃的温室中培养24~48小时，以检查灭菌是否彻底。本实验分离用培养基的配方:A．1/5NB培养基(各成分取1/5)营养肉汤（nutrient broth)培养基（1L）：　　牛肉膏（beef extract） 3g /l；　　蛋白胨 (soy peptone) 5g /l；　　pH 7.0B．喹啉降解菌分离用培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl2·2 H2O 0.025MgCl2·6 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTA·Na2 0.015FeSO4·7H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3

0.505配制时每一成分逐一溶化，否则会产生沉淀。以喹啉作为唯一碳源时，喹啉的加入量为0.5～2 mmol/L（或40ul/L～150ul/L）。对于固体培养基，喹啉的加入量为每块平板2ul～10ul喹啉(置于培养基表面)。*喹啉要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。　　C．反硝化富集培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl2·2 H2O 0.025MgCl2·6 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTA·Na2 0.015FeSO4·7H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3 0.505乙酸钠 1酒石酸钠钾 2* 喹啉（苯酚） 40ul（300mg） 配制时每一成分逐一溶化，否则会产生沉淀。 *喹啉（苯酚）要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。D. 1/10TSA(Tryptic soy agar)培养基（各成分取/10）：胰蛋白胨 15 g/l, 大豆胨 （Soytone） 5 g/l, NaCl 5 g/l, 琼脂 15 g/lE．苯酚降解菌分离用培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl2·2 H2O 0.025MgCl2·6 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTA·Na2 0.015FeSO4·7H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3 0.505配制时每一成分逐一溶化，否则会产生沉淀。以苯酚作为唯一碳源时，苯酚的加入量为200～800 mg/L。苯酚要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。F．R2A培养基酵母提取物 0.50 g /l胰蛋白胨 0.25 g /l大豆胨 （Soytone） 0.25 g/l, 酸水解酪素 0.50 g /l葡萄糖 0.50 g/l 可溶淀粉 0.50 g /l丙酮酸钠 0.30 g/l K2H PO4 0.30 g/lMgSO4·7H2O 0.05 g/l 琼脂 15.00 g /l在加入琼脂前用结晶的磷酸氢钾或磷酸二氢钾调整最终PH值为7.2。加入琼脂后，加热培养基使其沸腾，琼脂溶解后在121℃高压灭菌15分钟。LB液体培养基配方蛋白胨

10g酵母粉 5gNaCl 10gH2O 1000mlpH7.2五、 思考题1、 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？2、 你所配培养基的用途是什么？并说明其理由。3、 高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？