第二篇：实验三 微生物培养基的配制和灭菌

微生物实验三—
             微生物培养基的配制和灭菌

一、目的要求

了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

二、实验材料

药品： 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O等。

仪器：高压蒸汽灭菌锅、天平、牛角匙、电炉、pH试纸、量筒、烧杯、漏斗、漏斗架、玻棒、三角瓶、带棉塞的无菌试管、吸管、报纸、绳索、棉花、标签等。

三、 实验原理

    培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。

1.按组成成分可分为: 合成培养基、半合成培养基、天然培养基

2.从培养基的物理状态可分为：                                         液体培养基：不加凝固剂

    固体培养基：加入2%左右的凝固剂                                                     半固体培养基：加入0.2—0.5%凝固剂

 3.按用途分：

    基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于分离和培养细菌的基础培养基，又称天然培养基。

   配方如下：

   牛肉膏                        3 g                                                         蛋白胨              10 g                                                            氯化钠                 5 g                                                                   琼脂                           20 g                                                                               自来水                       1000 mL                                                                 pH                                                          7.2~7.4

 

淀粉琼脂培养基（高氏一号），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。

   配方如下：

   可溶性淀粉                     20.0 g                                              KNO3                              1.0 g                                                          K2HPO4                          0.5 g                                                      MgSO4? 7H2O                0.5 g                                                      NaCl                                0.5 g                                                                  FeSO4? 7H2O                  0.01 g                                                               琼脂                                 20 g                                                                        自来水                                                       1000 mL

 pH                                                          7.4－7.6

  查氏培养基，用于分离和培养霉菌，是一种合成培养基。

   配方如下：

     NaNO3                              2.0 g                                                          K2HPO4                                                        1.0 g 

     KCl                                                       0.5 g                                                                 

    MgSO4                                                     0.5 g

     FeSO4                                                     0.01 g                                                               

     蔗糖                                                       30g

    琼脂                                   20 g                                                                            自来水                                                       1000 mL

     pH                                                       自然

四、实验过程

   1、培养基的配制步骤:

     称量：按照配方正确称取各种原料放在烧杯中。

     溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。

     调pH值：用1N NaOH或1 N HCl调pH，用pH试纸对照。

     加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。

     分装：注意不要污染棉塞。

     包扎：包扎成捆，注明何种培养基。

     灭菌：培养基灭菌后必须在37 0C下恒温培养24 h，确定无菌生长，方可使用。

（2）加压蒸汽灭菌法原理：

    将待灭菌的物品放入灭菌锅，通过加热，使锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100 0C的温度。导致菌体蛋白质的凝固变性而达到灭菌的目的。

      干热灭菌法：   在电热烘箱（160－170 0C ）中灭菌2 h，适用于玻璃仪器吸管、培养基、试管等。

      过滤除菌法：                                                                                                    不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。

      紫外线灭菌法：                                                                                         一般30 W灯管，9 m3空间，距地面2 m每次打开紫外线照射0.5 h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。

      化学药剂消毒灭菌：                                                                              微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂.

      加压蒸汽灭菌步骤：

    1.灭菌器内加入一定量的水，放入需灭菌的物品。

    2.接通电源，加热。

    3. 排冷空气，将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。                                                                                                                       4.当压力达时0.1 MPa，温度121 0C，维持20 min。                                                                                            5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。

6.摆试管斜面培养基。

五、实验任务（2人一组）：

（1）配制200 ml的牛肉膏蛋白胨培养基，用1个大三角瓶装或者用2个小三角瓶装;

（2）配制100 ml的高氏一号培养基，用10支试管分装（装量不超过管高的1/3);

  ( 3 )  配制200 ml的查氏培养基，用1个大三角瓶装或者用2个小三角瓶装;

（4） 灭菌;

（5） 摆试管斜面，斜面长度不超过试管总长的一半.

六、思考题

1. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

2. 配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

4.在使用高压灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？