实验一培养基的制备与灭菌

一、实验目的

1. 了解配制培养基的一般方法和步骤；掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖（蔗糖）培养基的制备方法。

2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。

二、实验器材

1. 药品：牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；葡萄糖（蔗糖）；琼脂；1N NaOH；1N HCl等。

2. 仪器及其他：试管；锥形瓶；量杯；玻璃棒；漏斗；纱布；棉花；报纸；天平或台秤；马铃薯；电炉；铝锅；灭菌锅等。

三、实验方法

（一）配制培养基的基本过程：

（1）称量：按照培养基配方，称取各种原料放于锅中；

（2）溶解：锅中加入所需水量（自来水），加热溶解。要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分；

（3）调pH值：按配方要求调节；

（4）过滤：用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。

（5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：斜面培养基 装入的培养基约为试管高度的l/5～1/4，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

（6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。

制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞（见图）。

棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作时不慎沾上培养基则不可再用。

（7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用笔注明培养基名称、组别、日期。

（8）灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌30min。

（9）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

（10）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

(二)灭菌方法  采用高压蒸气灭菌法灭菌，步骤如下：

（1）打开锅盖，内层锅装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

（2）加适量水。

（3）加盖，旋紧螺栓，勿使漏气。

（4）加热，并同时打开上排气阀，水沸腾排气后打开下放气阀，以除锅内的冷空。让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用121.5℃，30min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽。

(5)灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

（6）取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

（三）培养基配方：

1. 肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）

牛肉膏 5g；  蛋白胨 10g；  氯化钠 5g；  琼脂 15～20g；水  1000mL；    pH  7.2～7.4

牛肉膏可放在载玻片上称量，放锅中溶解后取出玻片。

可免过滤步骤。

2、马铃薯葡萄糖培养基（用于培养真菌）

马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，1000 mL自来水；pH自然。

制法：将马铃薯去皮，并切成薄片，每加，煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液放入干净锅中，加入琼脂和糖溶化后待分装。

四、注意事项

1、准确称量；

2、注意搅拌；

3、分装前补足水量；

4、分装时不使培养基沾到管口（瓶口）；

5、灭菌时要排净冷气。

图   棉塞的制作过程

第二篇：实验一 培养基的制备和灭菌

实验一 培养基的制备和灭菌

培养基的制备

一、 实验目的

1. 了解配制培养基的原理和熟悉常用培养基的名称。

2. 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、 实验原理

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，在调整pH。

此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，此外，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微

生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。

以牛肉膏蛋白胨培养为例，牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培养配方： 马铃薯培养基的配方：

牛肉膏 3g 马铃薯 200g

蛋白胨 10g 蔗糖或葡萄糖 20g

NaCl 5g 琼脂：15～20g 琼脂 15－20g 水：1000ml 自然pH

水 1000ml 马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱

pH 7.4－7.4 布过滤，再加

糖及琼脂，溶化

后补足水分，

121℃灭菌

30min

三、实验器材

1、 溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH， 1mol/L HCL

2、 仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸，胶塞，纱布，报纸，棉绳，记号笔等

四、操作步骤

1. 称量：按照培养基配方，准确称取各成分放入烧杯中。有些原料用量少，不易称量，可先配成高浓度溶液，再按比例换算后，取一定量加入烧杯中。

2. 溶化 ：加入所需要的水量搅匀，然后加热使其溶解。有些原料不易溶解，如蛋白胨、牛肉膏等，可先在小容器中加水少许，加热溶解后倒入烧杯中。配制固体培养基时，在琼脂熔化过程中要不断搅拌，并控制火力，防止培养基溢出或烧焦。当培养基完全熔化后要补足水分。

3. 调pH ：先用pH试纸进行比色。如果偏酸或偏碱，可用1mol/LHCI和1mol/LNaOH调整pH值至所需范围。

4. 过滤：培养基中有些成分没完全溶解，则需过滤。常用滤纸、

纱布（叠成6层）或纱布间加脱脂棉花过滤。加琼脂的培养基要趁热过滤。

5. 分装：根据需要将培养基分装各种不同的容器中。固体培养基都要趁热分装，各容器的量如下：

三角瓶：一般不超过1/2；试管：视需要而定，若制斜面一般装管高的1/5或1/4；倒平板一般是用时再倒。分装时应避免培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞而引起污染。

6. 加塞 ：用合适的胶塞塞好

7. 包扎：加塞后，用报纸（或牛皮纸）包 好，再用棉绳捆绑好。然后标明培养基的名称，组别以及日期

8. 灭菌

9. 搁置斜面

10. 无菌检查

五、实验报告：

高压蒸汽灭菌

一、目的要求

1. 了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围

2. 学习高压蒸汽灭菌的操作方法

二、基本原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，是灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继

续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效果。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于冷空气的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

三、操作步骤

1. 首先将内层锅桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2. 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。

3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4. 加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排除后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽

压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5. 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降为0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

6. 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。