1、质粒DNA的提取与纯化实验教案
2、质粒DNA的酶切与电泳检测实验教案
3、植物基因组DNA的提取和纯度鉴定实验教案
4、聚合酶链式反应(PCR)基因扩增实验教案
5、DNA体外重组实验教案
6、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验教案
第二篇:实验三、质粒DNA的提取
实验三、质粒DNA的提取和电泳
一、实验目的
学习和掌握碱裂解法提取质粒;学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的方法和技术。
二、实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互缠绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那木迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒,有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称
CCCDNA);开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂,(open circular DNA, 简称OCDNA);线状质粒DNA ,即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂,(linear DNA,简称L DNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA和开环质粒DNA。
三、主要试剂
1. 溶液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris.HCl(pH 8.0)
10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na(EDTA)(pH 8.0)
2. 溶液 Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH 母液稀释), 1% SDS,用前等体积混合(新鲜配制)
3. 溶液 Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4. 70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
5. RNaseA
将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中,配成
10 mg/ml的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
7. LB+Amp培养基:LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温
分解,待培养基温度低于60℃时加入。
8. 50 x TAE:
Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
pH 8.0
9. 1%琼脂糖凝胶:
称0.3g琼脂糖,放入250 mL三角瓶内,加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液,加热煮沸等其冷至60℃左右,倒入封好的电泳板上。
10. 10X Loading buffer
四、仪器耗材
恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉。
五、实验步骤
(一)细菌的培养
将含有pUC19质粒的大肠杆菌,在LB+Amp100培养基平皿上划线,获得单菌落。(37℃培养过夜)
(二) 质粒提取
1. 将2 mL含Amp(100ug/mL)的LB液体培养基加入试管中,接入上述的含pUC19质
粒的大肠杆菌(单菌落),37℃振荡培养过夜。
2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中,4000 r/min 离心2 min。
3. 倒出培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液Ⅰ中,充分振荡混匀,室温放置5-10 min。
5. 加200 uL溶液 Ⅱ(新鲜配制),盖紧管口,颠倒混匀内容物(勿剧烈震荡),将离心管
放冰上5 min 。
6. 加入150 uL溶液 Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。冰上放置
5 min 。
7. 12000 r/min ,离心15 min ,将上清转至另一离心管中。
8. 向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),反复混匀,10000 r/min,离心10 min,
将上清转移到另一离心管中。
9. 向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置15~20min。12000r/min离心
10 min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
10. 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气
中干燥。
11. 加入适量(30 μL)的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶,使DNA完全溶解,
-20℃保存。
(三)琼脂糖电泳检测
将样品5uL与上样缓冲液0.5 uL混合,用移液枪将该混合样品加入样品孔(记录点样顺序及点样量)。同时加入DNA marker。120v电泳大约20-30min。
六、作业
1、分析电泳图谱。
2、提取过程中,加入酚:氯仿:异戊醇的目的是什么?
3、如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动,你认为可能是什么原因?