实验一 黄柏中盐酸小檗碱的提取分离与鉴定（10学时）
【目的要求】
1. 掌握黄柏中提取盐酸小檗碱的原理和方法。
2. 熟悉盐酸小檗碱的化学性质和鉴定方法。
3. 掌握渗漉法、盐析法、结晶法的基本操作方法。
【实验原理】
黄柏为芸香科(Rutaceae)植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid）及黄柏树(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥树皮。树皮中含有小檗碱(Berberine)、木兰花碱(Magnoflorine)、黄柏碱(Phellodendrine)等多种生物碱及内酯、甾醇等，其中以小檗碱为主要药效成分(中华人民共和国药典，2000)，含量为1.4%-5%(川黄柏含量较高)。其性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解表、退虚热之功效。
1.小檗碱(berberine)异名黄连素，分子式[C20H18NO4]+，分子量336.37，黄色针状结晶。作为临床上一种常用的广谱抗菌药，小檗碱主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染。 现代研究证明小檗碱有抗肿瘤、抗心率失常、降压、降血糖等作用，在临床上有越来越广泛的应用，需求量日益增加。
2.溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。
3.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，先将药材用石灰水润湿，使药材吸水膨胀，小檗碱游离，同时可使黄柏中含有的粘液质沉淀。用水渗漉法提取小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出，结合盐析法得到盐酸小檗碱。
【实验步骤】
1.提取 称取黄柏粗粉100g置大蒸发皿中，加入适量石灰乳搅拌均匀，放置溶胀20min，加入6倍量的饱和石灰水（或1%Ca(OH)2溶液）浸泡30min后装入渗漉筒内，以5～6mL/min速度渗漉。收集渗漉液500～600mL即可停止渗漉。
2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12，静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量6%-8% NaCl，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。
3.精制 将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI调pH 2左右，放置1-2小时，滤取结晶，纯化水洗至pH 4，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。
4.盐酸小檗碱的鉴别
（1）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL溶解后，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。
（3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。
【基本操作注意事项】
1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。
2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。
3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。
【思考题】
1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？
2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。
3. 试析生物碱的分离方法
实验二 槐花米中芸香甙的提取、精制和检识（12学时）
一、槐米中芦丁的提取
槐米系豆科槐属植物（Sophora japonica L．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。
槐米的主要化学成分为芦丁，亦称芸香苷，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁广泛存在于植物界，已发现的含芦丁植物至少在70种以上，其中以槐花米和荞麦叶（含量约8%）含量较高，可作为提取芦丁的原料。
药理实验证明芦丁具有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要用为防治高血压病的辅助治疗药物。芦丁可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症。此外，芦丁对于放射线伤害所引起的出血症亦有一定作用。
[目的要求]
1、通过芦丁的提取与精制掌握碱－酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2、得到芦丁粗品。
[实验原理]
芦丁（rutin）：C27H30O16·3H2O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。
槲皮素（quercetin）：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。
芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。
芦丁的结构如下：
[仪器与试剂]
仪器：电炉、研钵、石棉网
玻璃仪器：抽滤瓶、布氏漏斗、玻璃棒、1000ml烧杯、500ml烧杯、漏斗
试剂：槐花米、饱和石灰水溶液、盐酸、pH试纸
其他：滤纸
[实验内容]
于1000ml烧杯中加入500ml饱和石灰水，煮沸2~3min后，称取50g槐花米（粗粉），加热微沸30min，注意添加水保持原体积并维持pH8~9，趁热用脱脂棉过滤，滤渣再加入300ml饱和石灰水，维持pH8~9，煮沸10min，趁热用脱脂棉过滤，合并滤液，稍冷（60~70℃），用浓HCl调至4~5，放置1h使沉淀完全，抽滤，用水洗3~4次，置80℃烘箱低温干燥得淡黄色粗制芦丁，称重，计算产率。
注意事项：
（1）开始用沸水提取。
（2）提取液要趁热过滤。
（3）提取时要不断补充水分。
注意：加入饱和石灰水溶液既可以达到碱溶解提取芦丁的目的，又可以除去槐花米中大量多糖粘液质。也可直接加入150mL水 和5gCa(OH)2粉末，而不必配成饱和溶液。
[思考题]
1、提取液为什么要趁热过滤？
二、芦丁的精制和酸水解
[目的要求]
1、芦丁粗品重结晶，得到芦丁精品；
2、芦丁酸水解，得到苷元槲皮素精品及糖水解液。
[实验原理]
1、芦丁可溶于热水，难溶于冷水。其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱中易溶解，而在酸性条件下易析出沉淀。故可采用碱提酸沉法提纯芦丁。
2、利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖。
[实验内容]
1、将芦丁粗品置500ml烧杯中，加适量（按芦丁：水＝1g：200ml）蒸馏水，于石棉网上加热溶解，趁热抽滤。滤液静置30min，即析出沉淀。抽滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2~3次，抽干，于70~80℃干燥1小时，即得精制芦丁。称重，计算产率，测mp（文献值为174~178℃）。
2、取芦丁粗品1g，研细，置于250ml圆底烧瓶中，加2%H2SO4溶液200ml，于直火上加热回流30min，析出的黄色沉淀为槲皮素，放冷，静置，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。沉淀经水洗后再用95％乙醇重结晶1次，得黄色针状结晶，于70~80℃以下干燥，即得精制槲皮素。计算收率。
三、芦丁、槲皮素的鉴定
一、实验目的
1、学习黄酮类化合物的颜色反应
2、黄酮苷及苷元的硅胶层析方法
二、实验原理
1、HCl-Mg反应：盐酸镁粉反应是检查中药中是否有黄酮类化合物的最常用方法之一。在样品的乙醇或甲醇溶液中加入少许镁粉振摇，再满加几滴浓盐酸，l－2分钟（必要时水浴上加热）即显出颜色。黄酮、黄酮醇类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类化合物一般显红色到紫红色，个别显蓝或绿色（如7，3’，4’一三羟基二氢黄酮）。分子中特别是在B环上有-OH或-OCH3。取代时颜色随之加深。
2、Molish反应：黄酮的糖苷首先在浓硫酸作用下水解成相应的苷元和单糖，然后发生了单糖的脱水和颜色反应。单糖在浓无机酸的作用下脱水生成糠醛或糠醛的衍生物。戊糖变成糠醛，己糖相应地生成5-羟甲基糠醛。
Molish反应用浓硫酸作脱水剂，再与二分子α-萘酚缩合成醌型化合物而显紫色，反应如下：
3、AlCl3：络合反应。凡3位或5位有羟基的黄酮会因与Al产生络合物而显鲜黄色。
三、实验方法
1、取精制后的芦丁和槲皮素各10mg，分别与5ml乙醇配制成样品溶液，备用。
2、HCl-Mg反应：取样品溶液各1ml，加少许镁粉，加2滴浓HCl，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色，观察颜色变化，比较芦丁和槲皮素的不同。
3、Molish反应：
各取溶液1ml，加5%α-萘酚（乙醇溶液）试剂1~2滴，摇匀。倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约1 ml静置。观察两层溶液的界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖的结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芦丁和槲皮素的不同。
4、1%AlCl3（乙醇溶液）：取样品溶液各1ml，加入1ml 1%AlCl3，观察颜色变化，比较芦丁和槲皮素的不同。
实验三 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定（12学时）
一、目的和要求
1、了解从大黄中提取游离蒽醌类化合物的提取分离的基本原理和方法。
2、掌握pH梯度法的原理及操作技术。
3．学习蒽醌类化合物鉴定方法。
二、原理
大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。
自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：
大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有β-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。
三、实验步骤
1．大黄总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉50 g，加20％硫酸溶液150 ml润湿，再加氯仿200 ml，回流提取2 h，稍冷后过滤，残渣弃去，氯仿提取液于分液漏斗中，分出酸水层，得氯仿提取液。
注意：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌苷的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。
2．蒽醌类成分的分离与精制
(1) 大黄酸的分离与精制
将含有总游离蒽醌的氯仿液225ml移至500ml的大分液漏斗中，加5%碳酸氢钠溶液振荡提取，水层呈紫红色。分出水层，再重复提取数次（消耗碳酸氢钠溶液总体积约140ml），直至不显红色为止。合并水层，用盐酸酸化至pH3左右，即得黄色沉淀。过滤，用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。干燥，干燥后的样品加冰醋酸5ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。
(2)大黄素的分离与精制
将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用5%碳酸钠溶液振荡提取数次（消耗碳酸钠溶液总体积约140ml），水层呈红色，合并水层，加盐酸至pH=3，得黄色沉淀，过滤，用水洗沉淀，再以少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。沉淀经干燥后，用5ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。
(3)芦荟大黄素的分离和精制
余下氯仿液移至分液漏斗后，用0.25%氢氧化钠溶液振荡提取数次(消耗氢氧化钠溶液总体积约270ml)，水层呈红色，合并水层，加盐酸至酸性，得橙色沉淀，过滤，用水洗沉淀，干燥，用5ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。
(4)大黄酚和大黄素甲醚的分离和精制
将上述0.25%氢氧化钠溶液提取后的氯仿层以5%氢氧化钠溶液振荡提取数次至无色。水层呈深红色，合并水层，加盐酸至酸性，得黄色沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥后得大黄酚和大黄素甲醚混合物。
3.蒽醌类成分的鉴定
(1)蒽醌类成分化学鉴定
a. Brontrager’s反应
分别取各蒽醌结晶数毫克置于小试管中，加2％氢氧化钠溶液l ml，观察颜色变化。凡有互成邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。
b.醋酸镁反应
分别取蒽醌结晶数毫克，置于小试管中，各加乙醇l ml使溶解，滴加0.5％醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化。
（2）色谱鉴识
薄层板：硅胶G板
点样：提取的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的混合物
展开剂：石油醚－乙酸乙酯－甲酸（15：5：1）
展开方式：上行展开
显色：可见光观察，下观察，记录黄色斑点出现的位置。
观察记录：记录图谱并计算Rf值。
思考题：
1.大黄中5种羟基蒽醌的酸性和极性大小应如何排列？为什么？
2.pH梯度法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？
第二篇：药化实验
实验一 槐米中芦丁的提取、精制及含量测定
一、实验目的
1.掌握水提取法提取黄酮苷的原理及方法。
2.掌握芦丁的精制方法
3.掌握分光光度法测定芦丁含量的方法
二、实验原理
芦丁可溶解于热水，利用不同温度条件下，物质的溶解度不同的特性，通过降低温度使芦丁的浓度达到饱和状态而结晶析出。
三、实验用品
仪器：粉碎机、样品筛、电炉、石棉网、布氏漏斗、滤纸、脱脂棉、真空泵、抽滤瓶、天平、圆底烧瓶、冷凝回流管、层析缸、毛细点样管、电吹风、显色喷瓶、分光光度计。
材料：槐花米。
试剂：蒸馏水、硫酸、乙醇、色谱纯甲醇、甲酸、芦丁对照品等。
四、实验方法
1.芦丁的提取
取槐米20 g，加沸水250 ml，煮沸提取30min，纱布或脱脂棉趁热过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液。将滤液适当浓缩（原体积一半）后室温放置析晶，待全部析出后，减压抽滤，用冷蒸馏水洗涤芦丁结晶，抽干，得粗制芦丁（若抽滤堵滤纸可采用离心的方法：离心12000rpm，10min），置空气中干燥后，称重。芦丁得率（％）＝粗制芦丁（g）÷粗粉重量（g）×100％。
2.芦丁的精制纯化
取粗制芦丁，按照1:60加入蒸馏水，煮沸15min，趁热抽滤，滤液冷却静置后即可析出晶体，抽滤，得芦丁精制品，置空气中干燥后，称重。
3.芦丁的水解（槲皮素的制备）
取精制芦丁适量，研细后置于250 ml圆底烧瓶中，按照1:70的量加入2％硫酸，加热回流40~60min，生成鲜黄色沉淀，放冷沉淀，抽滤，沉淀物为芦丁的苷元即槲皮素，用蒸馏水洗至中性，抽干水分，晾干，称重即为粗制槲皮素。粗制槲皮素再用95％乙醇回流溶解，趁热过滤，加蒸馏水至乙醇浓度为50%，重结晶得精制的含2分子结晶水的槲皮素。
4.芦丁和槲皮素的薄层层析
4.1点样：在距离薄层板下边缘2cm处用毛细管点样，原点直径不应超过2～3mm，原点之间距离约为1～2cm。本实验点1、2、3、4四个样点（1为精制的芦丁，2为芦丁标准品，3为粗制槲皮素，4为精制槲皮素）。
4.2展开：点样后选择合适的展开剂在层析缸内展开。展开剂的选择，可以参考文献中和自己研究的样品类似物质的分离，也可以在薄层板上每隔2～3cm距离点上样品溶液，待斑点上的溶剂挥发后，向各斑点上分别滴加不同的展开剂展开如图比较，A～D四种溶剂，溶剂B比较适当。单一的溶剂分离效果不佳时，可以调制混合溶剂进行实验。溶剂前沿接近薄层板上端时，取出薄层板停止展开。本实验中展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水（8:1:1）展开，展距12cm。
4.3显色：取出的薄层板记录溶剂前沿位置，挥发干展开剂后，用显色剂进行显色。在薄层板上喷雾10％～20％硫酸后，于100℃以上加热，就可以出现灰褐色斑点，或者在碘蒸气中薰，则出现褐色斑点。这两种显色方法几乎适用于全部有机化合物。本实验用碘蒸气显色后观察样品斑点的位置，并计算Rf值。
4.4计算Rf：原点至溶剂前沿距离为a，样品斑点中心至原点距离为b，则Rf＝b/a 。一般鉴定纯化合物时，Rf值最好在0.4～0.6之间。被分离物质在展开剂中的Rf值之差最好大于0.05 。
5.槐米中芦丁含量测定
5.1色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱（25cm×4.6mm×5μm），以甲醇-1%冰醋酸水溶液（32：68）为流动相；流速为1.00ml/min；进样量为20μl；柱温为25℃；检测波长257nm。
5.2 标准曲线的制作
精确称取120℃真空干燥恒重的芦丁对照品7.9mg（或适量），用甲醇定容于50ml容量瓶中，摇匀，得对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.50、1.00、2.00ml于10ml容量瓶中用甲醇定容，然后在上述色谱条件下进样，测定峰面积，以芦丁对照品浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，进行线性回归绘制标准曲线。
5.3 槐米中芦丁含量的测定
精密称取槐米干燥粉末0.1g置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml,称重，超声提取30min（功率250W，频率25kHz），冷却后称重，甲醇补足失重，摇匀过滤。精密量取续滤液2ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取适量样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试样品液，进样20μl供试样品液进行色谱分析，计算峰面积，代入回归方程计算样品中芦丁的含量。
5.4 精制芦丁纯度的测定
精密称取精制芦丁0.1g置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml,称重，超声提取30min（功率250W，频率25kHz），冷却后称重，甲醇补足失重，摇匀过滤。精密量取续滤液2ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取适量样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试样品液，进样20μl供试样品液进行色谱分析，计算峰面积，代入回归方程计算样品中芦丁的含量，并计算精制芦丁样品中芦丁的纯度。
六、作业
1.计算热水提取芦丁的得率？
2.计算从粗制芦丁到纯化后芦丁的得率。
3.计算由芦丁水解产生粗制槲皮素的得率，乙醇结晶纯化后精制槲皮素的得率。
4.记录芦丁和槲皮素薄层色谱行为并计算Rf值。
5. 线性回归，绘制芦丁标准曲线通过标准曲线计算槐米中芦丁的含量和精制芦丁样品中的芦丁的纯度。
实验二 HPLC法测定甘草中甘草苷的含量
一、实验目的
1. 了解HPLC原理
2. 掌握HPLC测定甘草苷含量的方法
二、实验用品
仪器：岛津LC－20A高效液相色谱仪、岛津PDA检测器、 色谱工作站、赛多利斯万分之一天平。
材料：甘草饮片。
试剂：甲醇、冰醋酸、色谱纯乙腈、超纯水、甘草苷对照品等
三、实验方法
1.色谱条件
色谱柱：C18（25cm×4.6mm×5μm），流动相乙腈-0.5%冰醋酸(1 ∶ 4) ，流速0. 8 mL/min，检测波长276 nm，柱温室温，进样体积10 μL。
2.标准曲线的制作
精密量取甘草苷对照品2mg于10ml容量瓶，甲醇溶解配制200μg/ml对照品储备液，然后倍比稀释为50、20、10、5、1μg/ml（分别取200μg/ml对照品储备液2.5、1，0.5，0.25，0.05ml，20％乙腈定容至10ml），然后将200、50、20、10、5、1μg/ml对照品溶液分别进样10 μL。按色谱条件测定甘草苷峰面积。以对照品量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
3.甘草供试样品的制备及其甘草苷含量的测定
精密称取甘草样品粉末0.4g于100ml锥形瓶中， 精密加入70％乙醇20ml，精密称定后，置于超声波清洗仪中提取30min，取出冷却至室温，称重，补足失去的溶剂量过滤后 精密量取滤液0.5ml于10ml容量瓶中，用20％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试样品溶液C。
精密称取甘草样品粉末0.4g于150ml圆底烧瓶中， 精密加入70％乙醇20ml，精密称重后置于水浴回流提取30min，取出冷却至室温，称重，补足失去的溶剂量，抽滤。 精密量取滤液0.5ml于10ml容量瓶中，用20%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试样品溶液H。
取适量不同方法制备的供试样品溶液（C和H），用0.45μm微孔滤膜过滤后取10μl进行色谱分析，计算峰面积，代入回归方程计算样品中甘草苷的含量。
四、作业
1.线性回归，绘制甘草苷标准曲线
2.通过标准曲线计算不同提取方法供试样品液中甘草苷的含量，并比较两种提取方法的优劣
实验三 超声、回流及压力快速溶剂三种提取方法提取葵花籽油
一、实验目的
掌握超声波提取、加热回流提取及压力快速溶剂提取法的原理及操作方法。
二. 实验原理
1. 超声波提取法
超声波振动产生并传递强大的能量，大能量的超声波作用在液体里，在振动处于稀疏状态时，液体会被撕裂成很多的小空穴，这些小空穴一瞬间即闭合，闭合时产生高达几千大气压（称为空化效应）。这种空化效应在溶剂内部产生强烈冲击波和速度极快的微射流，能使细胞壁破裂，使细胞里边的物质释放出来。在油脂的提取中加快了油脂的渗出速度，提高了出油率。
2.加热回流提取法
当溶剂加到原料中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出。回流提取采用回流加热装置，在水浴中加热回流，以免溶剂挥发损失。
3.压力快速溶剂萃取
压力快速溶剂萃取（Pressurized Solvent Extraction， PSE）通过升高压力来提高溶剂的沸点，使萃取循环在常温下进行，所得到的萃取物（状态不变）维持天然活性产物原有的特性。大大缩短萃取时间提高萃取效率并显著降低溶剂消耗。此外，循环能自动重复多次，从而确保提取物的充分完全萃取，因此特别适合处理坚硬的物料如根、皮、叶等。
三、实验用品
仪器：粉碎机、样品筛、恒温水浴、超声提取仪、布氏漏斗、滤纸、真空泵、抽滤瓶、天平、圆底烧瓶、冷凝回流管、压力快速溶剂萃取仪、旋转蒸发仪等。
材料：葵花籽。
试剂：石油醚。
四、实验方法
1.葵花籽油的超声波提取法
精密称取向日葵种子100.00g，剥壳，50℃烘干，研磨，过20目筛。取15.00g粉末于150 mL锥形瓶中，加入105.00 mL石油醚。设定超声频率59 kHz，功率210W，超声时间15 min，温度40℃。三角瓶置于超声波提取仪中提取15min，重复提取两次。抽滤，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，得到葵花籽油置于青霉素小瓶中，玻璃真空干燥器中干燥，称重。计算出油率。
2. 葵花籽油的回流提取
精密称取干燥的向日葵籽仁粉末15.00g于圆底烧瓶中，加入105.00mL石油醚(沸程30~60℃ )，回流提取6.0h，混合物经过滤后，减压旋转蒸发回收溶剂，油脂干燥后称重，计算出油率。
3. 葵花籽油的压力快速溶剂提取
精密称取120.00g葵花籽粉末，800mL石油醚，设定时间为10min，提取温度室温，压力为60bar，进行萃取。所得葵花籽油干燥后称重，计算出油率。
五、作业
1.出油率测定后测定后比较三种提取方法的优劣
实验四 高速逆流色谱法快速分离锁阳中的原儿茶酸
一、实验目的
1.了解高速逆流色谱的工作原理
2.掌握高速逆流色谱分离甘草酸的方法
二、实验原理
高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点：（1） 无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液- 液色谱系统，故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；（2）高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同步完成，故特别适于制备性分离；（3）操作简便。因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC 相比，HSCCC 进样量较大，最多可达数克。
三、实验用品
仪器：TBE-20A 高速逆流色谱仪、恒流泵、紫外检测器、岛津LC-20A高效液相色谱仪。
材料：干燥锁阳药材
试剂：分析纯正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、蒸馏水等溶剂。
四、实验方法
1.锁阳乙酸乙酯提取部位的制备
100g锁阳肉质茎粉末（过30 目筛）用300ml的70%丙酮水溶液浸提3 次，每次24 h。提取物过滤合并后40 ℃减压浓缩。粗提物用水分散后依次用正己烷（HF）、氯仿(CF)、乙酸乙酯(EAF)萃取得各萃取部分。乙酸乙酯萃取物40℃减压蒸干后用于分析与分离实验。
2.HSCCC溶剂体系及样品的溶解
溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:3:1:3，v/v/v/v）。室温下在分液漏斗中按比例混合上述溶液，以上相作为固定相，下相作为流动相。锁阳乙酸乙酯提取物样品的溶解方案：样品溶解于20 ml 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:3:1:3，v/v/v/v）溶液中。
3.HSCCC分离锁阳乙酸乙酯提取物
所用溶剂体系分液漏斗中配制后摇匀，过夜。分液后分别超声脱气10 min，上层液体作为固定相首先以10 ml/min 流速泵入主机直至存满柱体积，下层液体（流动相）以从头到尾的方式按2 ml/min 泵入主机，同时开启主机，转速设定为850 rpm。254 nm 处检测流出液体吸光度，约2 h 基线稳定后通过六通阀进样（清洗进样针后吸取一定量样品液后将进样针插入进样阀，切换至load状态下打入定量环，然后换回inject状态再拔针，进样后进行零点校正。inject状态下清洗进样阀）根据所得实时色谱图收集流份。
五、作业
1.记录锁阳乙酸乙酯提取物的HSCCC分离色谱图
