第一章 黄柏中小檗碱的提取、分离与鉴定
教学目的要求掌握黄柏中小檗碱(季胺型生物碱)的提取原理和方法。
掌握干法装柱和湿法装柱的操作方法
1、 掌握鉴定小檗碱(已知化合物)的一般方法。教学重点难点季铵型生物碱的理化性质及提取方法。
2、 渗漉法的操作过程及注意事项。
3、 结晶法的注意事项
4、掌握薄层色谱鉴定的方法实验一 黄柏中盐酸小檗碱的提取
（一）实验原理
根据黄柏中含粘液质较多的特点，首先用石灰乳使粘液质生成难溶于水的钙盐，用碱水自黄柏中提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。小檗碱能缓缓溶解于水中，在冷乙醇中的溶解度不大，但易溶于热水或热乙醇，难溶于苯、氯仿、丙酮。小檗碱与酸结合脱去一分子水而成盐。小檗碱盐酸盐在冷水中溶解度小，较易溶于沸水，几不溶于乙醇，小檗碱的硫酸盐、磷酸盐在水中溶解度较小，与大分子有机酸生成的盐在水中的溶解度很小。黄柏中主要含有小檗碱，其结构如下
季铵式（红棕色） 醇式（黄色） 醛式（黄色）
小檗碱的三种互变异构体
川黄柏含小檗碱约1.37％～5.8％，关黄柏含小檗碱约0.60％～1.64％。
(二)实验方法
实验二 黄柏中盐酸小檗碱的纯化及鉴定
一、纯化
1.湿法装柱色谱法
吸附剂：中性氧化铝(100～200目)35g置于烧杯中，加入50ml 95％乙醇，调成浆状，湿法装柱。
上样：取50～100mg自制盐酸小檗碱，溶于少量95％热乙醇中，加入色谱柱中。
洗脱：95％乙醇洗脱，收集开始流出的鲜黄色带，即为纯化的盐酸小檗碱。
2.结晶法
抽率上次提取液，将得到的滤饼用少量水加热溶解，趁热抽率，滤液放冷等待析晶，再抽率得到晶体，即盐酸小檗碱纯品。
二、薄层色谱鉴定
将提取分离出的盐酸小檗碱样品与盐酸小檗碱的对照品共薄层色谱，比较其Rf值是否一致。
吸附剂：硅胶G薄层板
展开剂：① 苯一醋酸乙酯一异丙醇一甲醇一水(6：3：1.5：l.5：0.3)，氨蒸汽饱和。
②氯仿-甲醇-氨水(15：8：1) 显色剂：改良碘化铋钾试剂
1、渗漉前为什么要加入石灰乳搅拌？
2. 提取时加氯化钠的作用是什么？
3、在制备薄层色谱板时有哪些注意事项？
第四章 芦丁的提取、分离、精制和鉴定
1、掌握碱溶酸沉法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2、掌握黄酮苷的水解原理及操作
3、掌握黄酮类及糖类化合物的检识。
1、碱溶酸沉法提取的原理
2、黄酮的检识反应实验七 槐米中芦丁的提取
实验原理：芦丁结构中具有酚羟基，显酸性，可用碱溶酸沉法提取，碱用石灰水，酸用浓盐酸。
实验步骤：
称取槐米30g，在乳钵中研碎，置l000ml的搪瓷杯中，加入300ml饱和石灰水①(以棉花过滤至澄明)加热煮沸30分钟，趁热过滤(以棉花)，残渣再用200ml饱和石灰水煮沸30分钟。趁热过滤，合并两次滤液．加浓盐酸(边加边搅拌)调PH3～4②(放置过夜)次日倾出上清液，抽滤沉淀，蒸馏水洗至PH5～6，70℃干燥，得粗芦丁。
注意：
①加石灰乳既可以达到碱溶解提取芦丁目的还可以除去槐花米中的多糖类、粘液质等。
②酸化时PH过低会使芦丁形成烊盐而降低收率。
实验八 芦丁的精制、水解及鉴定
实验原理：芦丁在水中热溶冷不溶，可用水做溶剂，利用结晶法精制芦丁。
一、芦丁（芸香苷）的精制
水结晶法：率上次提取液，得芦丁粗品，加蒸馏水300ml，煮沸至芦丁全部溶解，趁热立即抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤，60～80℃烘干，得芦丁精制品。
二、芦丁的水解和槲皮素的分离
取芦丁1g置500ml圆底烧瓶中加2％H2SO4100ml回流30分钟，(加热约数分钟后，溶液完全澄清，20分钟后又逐渐析出黄色针状结晶)过滤即得槲皮素．必要时用稀乙醇重结晶即可得以含2个分子结晶槲皮素，110℃真空干燥，即可得无水物。
滤液：供糖的鉴定。
三、化学鉴定
取芦丁3～4mg，加乙醇5～6ml使溶解，制成样品溶液A，取槲皮素3～4mg，加乙醇5～6ml使溶解，制成样品溶液B，取芦丁的水解滤液为C，按下列方法进行试验。
呈色反应
(1)盐酸－镁粉反应 取样品溶液A和B各1～2ml，分别加2滴浓盐酸，再酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。
(2)锆盐－枸橼酸反应 取样品溶液A和B各1～2ml，分别滴加2％ZrOCl2的甲醇溶液3～4滴。注意观察颜色变化情况，再继续向试管中加入2％枸橼酸的甲醇溶液3～4滴，并详细记录颜色变化情况。
(3)a-萘酚反应(Molish反应) 取样品溶液C l～2ml，然后再加10％a-萘酚乙醇溶液2～3滴，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸lml，注意观察溶液界面产生的颜色变化。
2、薄层色谱鉴别（糖的纸色谱鉴定）
点样：取新华一号滤纸，15厘米长，宽度按需要决定。用毛细管点上以下溶液：
1、水解浓缩液 2、葡萄糖(Rf0.18)对照品溶液 3、鼠李糖(RfO.37)对照品溶液
展开：用正丁醇一醋酸一水(4：1：5)上行展开。
显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于100℃加热5分钟1、简述碱溶酸沉法的原理。
2、芸香苷水解时为何会出现沉淀——澄清——沉淀的现象
3、怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素C3-OH上?
第二章 大黄中游离蒽醌成分的提取、分离和鉴定1、掌握PH梯度萃取法的原理和操作技术。
2、掌握柱色谱法分离精制大黄酚的实验方法。
3、掌握羟基蒽醌类化合物的理化性质及鉴定方法。
1、PH梯度萃取法的原理和操作技术
2、柱色谱法分离精制大黄酚的实验方法
3、羟基蒽醌类化合物的理化性质及鉴定方法实验三 大黄中蒽醌类化合物的提取
实验四 大黄中游离蒽醌的分离及鉴定
1、化学检识：分别取大黄素、大黄酚等少许，用乙醚溶解，做如下反应：
A．碱液试验：取试液1ml，加20%NaOH数滴，观察颜色。
B．醋酸镁反应：取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。
2、薄层鉴定：
吸附剂：硅胶G－CMC-Na板
展开剂：石油醚（30~60℃）-乙酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层溶液。
显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH喷雾。
[实验说明及注意事项]
(1) 在乙醚提取过程中，如乙醚挥发，可酌量补加。
(2) 加HCl酸化时产生大量CO2气体,小心防止气体产生时，内容物溢出。
1、PH梯度萃取法的原理是什么?适用哪些中药成分的分离?
2、大黄酚、大黄素和大黄素-6-甲醚酸性及极性强弱，应如何排列?
3、根据虎杖中所含羟基蒽醌的结构，说明为什么它们可以分别被不同强度的碱性水溶液提取出来？
第八章 天然药物化学成分的预试验1、掌握植物主要成分试管预试及纸色谱、薄层色谱预试的一般方法。
2、了解未知成分的植物怎样进行初步分离，根据各类化合物的性质，判断该植物应含有什么类型的成分。1、药物化学预试验的意义
2、药物化学预试验的操作流程
实验十五 天然药物化学成分的预试验
一、样品液的制备液
1、水提取液
取样品粉末10g(过20目筛)，加水10倍量，室温浸泡过夜，滤取部分滤液，供检查氨基酸、多肽、蛋白质。剩余滤液和滤渣在60℃水浴中加热10分钟～1小时，过滤，滤液供检查糖、多糖、皂苷、苷类和鞣质、有机酸盐、生物碱盐等。
2、乙醇提取液
乙醇提取液可供黄酮、蒽醌、苷类、生物碱、有机酸、鞣质、香豆精、萜类、甾类及内脂化合物等项的检查。提取方法如下：
二、各类成分的检查
（一）氨基酸、多肽、蛋白质的检查
l、加热沉淀试验 取检液，加热至沸，如出现浑浊或沉淀时，表明有蛋白质；加入5％硫酸溶液也能出现沉淀。
2、茚三酮试验(Ninhydrin) 取检液，加入0.2％茚三酮的水溶液后，在沸水浴上加热5分钟，冷后，如有蓝或蓝紫色反应，表明含有氨基酸、多肽、或蛋白质；或将试液滴在滤纸片上，加入或喷洒0.2％印三酮溶液后，在100℃左右烘烤2分钟．如有氨基酸和肽则呈现紫红色或蓝色斑点，也有少数氩基酸呈黄色斑点。
（二）糖、多糖的检查
α-萘酚试验(Molish反应) 取检液．加热浓缩，使溶于乙醇中，再加等体积的10％α－萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，二液界面处产生紫红色环，表示有糖、多塘、苷类。
（三）酚类成分的检查
三氯化铁试验 取检液，加入l％三氯化铁乙醇溶液．溶液如呈现绿、蓝绿或暗紫色等，则有酚性成分存在，若有鞣质存在同样呈现正反应．可水解鞣质多呈蓝色．缩合鞣质多呈绿色。
（四）有机酸的检查
溴酚蓝试验 将检液滴在滤纸片上，再滴加0.1％溴酚蓝溶液，立即在蓝色的背景上显黄色斑点；如不够明显，再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝色变为黄色，而有机酸的斑点仍然为蓝色。
(五)皂苷的检查
泡沫试验 取检液，置于试管内，激烈振摇，如产生持续性泡沫，就可能含有皂苷、高级脂肪酸、蛋白质、粘液质。皂苷和脂肪酸盐，泡沫特别显著，在试管内能持续10分钟以上，即使加热、加乙醇，泡沫也不明显地减少。
(六)黄酮类化合物的检查
盐酸－镁粉试验 取检液，加入数滴浓盐酸及少量镁粉(或锌粉)，溶液如现樱红色，表示含有黄酮类化合物。如乙醇提取液加浓盐酸而不加镁粉即出现红色，表明含有花色素。
(七)蒽醌的检查
碱液试验 取检液，加入10％氢氧化钠溶液，如产生红色，加入少量30％过氧化氢溶液．加热，红色不褪，加酸使呈酸性．则红色消褪，表明含有蒽醌化合物；冷后，加乙醚振摇，加人氨液显红色。
(八)香豆素的检查
荧光试验 将检液滴在滤纸片上，干燥后，在日光下观察，有的香豆精类成分，可显天蓝色荧光，若于紫外灯下观察，多数香豆精类成分的蓝色荧光可转变为绿色荧光。呋喃骈香豆精类成分多显黄绿色荧光。
（十）生物碱的检查
碘化铋钾试剂：取检液三份，分别加人碘化汞钾试剂，如产生白色或淡黄色沉淀；加入碘化铋钾试剂，如有桔红色沉淀，或加入硅钨酸试剂，如有淡黄或灰白色沉淀，均表明含有生物碱。
上述各种成分的预试验，仅仅是为进一步提取分离有效成分提供初步的线索。由于植物中各成分的复杂性和相互间的干扰，各种定性反应都有例外情况。根据预试结果，就作出某种成分存在与否的结论是不全面的。例如碘化铋钾试剂，不仅对生物碱发生反应，对碱性氨基酸、生物胺等同样也发生反应。生物碱沉淀反应作为预试，如呈阴性还有一些意义，阳性反应则不能肯定就是生物碱存在。但通过预试，可以对中药成分有一大致了解，告诉我们可能含有的某类成分，如生物碱、糖类、苷类等，再配合薄层色谱，可进一步了解其中所含单体的个数和情况。系统预试虽有上述一些缺点，但在目前仍不失为检查中药化学成分的常用的简便方法。这类方法在今后的工作中，还需要不断地充实和改进。天然药物化学成分预实验的意义和方法？第五章 薄荷中挥发油的提取及鉴定1.掌握挥发油类成分的提取和鉴定方法
2.熟悉挥发油的组成、性质和生物活性
3.了解薄荷中的化学成分和药用价值重点：水蒸气蒸馏法提取薄荷挥发油的原理及操作要点。
难点：道尔顿分压定律
实验九 薄荷中挥发油的提取及鉴定
一、薄荷中挥发油的提取
取薄荷40g撕碎，置挥发油含量测定器1000ml烧瓶中，加350ml水与少量沸石，连接
挥发油含量测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止，缓缓加热至沸提取，至测定器中油量不再增加，停止加热，防冷，分取油层，计算得率。
二、薄荷中挥发油的鉴定
薄层色谱法
活化--点样—饱和—展开—计算Rf—喷香草醛-浓硫酸显色
观察斑点数目和颜色，并做记录。1.挥发油的组成？
2.计算提取率？
第三章 秦皮中香豆素的提取及鉴定
掌握用溶剂法提取、分离香豆素类成分七叶苷和七叶内酯的方法。
七叶苷和七叶内酯均能溶于沸乙醇中，可用沸乙醇将二者提取出来，利用在乙酸乙酯中两者溶解度的不同而分离之。实验五、六 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离及鉴定
（一）提取与分离
二）鉴定
1.荧光实验
2.异羟钨酸铁试验
3.TLC
展开剂：甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5：4：1）
样品：七叶苷、七叶内酯及其对照品的甲醇溶液
显色剂：紫外等下观察荧光
1. 萃取时，如何选择溶剂？
2. 一般情况下，都有哪几种方法用于分离苷和苷元？
第六章 绞股蓝总皂苷的提取分离及鉴别
1．掌握皂苷的提取方法。
2．熟悉大孔吸附树脂法纯化绞股蓝皂苷的操作技术。
3．熟悉皂苷及其制剂的鉴定方法。 绞股蓝总皂苷有较好的水溶性，可用水为提取溶剂，因为绞股蓝皂苷分子中含有非极性部分三萜母核，故可使其在非极性大孔树脂上能较好地被吸附，相反，极性较大的成分如糖类则在非极性大孔树脂上难以吸附，因而选用非极性大孔吸附树脂D101型可将绞股蓝水提物中的总皂苷与糖类等水溶性成分较好地分离，最后用活性炭脱色，从而达到纯化的目的
实验十 绞股蓝总皂苷的提取
（一）提取
取绞股蓝粗粉5g，加水80ml，超声振荡15min，过滤，残渣再加水60ml，超声振荡15min，过滤，合并两次滤液，用2％氢氧化钠溶液调至pH9～10①，静置，滤除沉淀，滤液备用。
实验十一 绞股蓝总皂苷的纯化与鉴定
（二）纯化
1．大孔吸附树脂的准备
取D101型大孔吸附树脂5g，用95％乙醇浸泡过夜后，湿法装柱（1.0cm×28cm），继续用95％乙醇洗涤至流出液加等量水后几乎无白色浑浊为止。然后用去离子水洗至无醇味。 2．纯化 将绞股蓝提取液以2m1／min的速度通过大孔吸附树脂柱②，待溶液全部进入柱后，用2％氢氧化钠溶液洗涤③，洗涤速度控制在5ml／min为宜。当流出液接近无色时，改用水洗，至流出液pH接近7为止。然后用95％乙醇洗脱，收集醇洗脱液至无绞股蓝皂苷洗出[薄层色谱法检查：硅胶H一CMC-Na板，正丁醇-乙酸乙酯-水（4：1：5）上层，5％磷钼酸乙醇液，110℃显色]。醇洗脱液加入少量活性炭回流10min④，趁热过滤，滤液回收乙醇至小体积，水浴蒸干，刮松，得白色鳞片状结晶，为绞股蓝总皂苷。大孔吸附树脂回收。
（三）鉴定
1．呈色反应
（1）醋酐一浓硫酸反应 取绞股蓝总皂苷少许，置蒸发皿中，滴加冰醋酸1ml溶解，再加1ml醋酐，然后于溶液边沿滴加浓硫酸，观察颜色变化。
（2）molish反应取绞股蓝总皂苷少许于试管中，加乙醇1ml溶解，滴加lmlα—萘酚试剂，然后沿试管壁加入2ml硫酸，不要摇动，观察两液交界面的颜色。
2．薄层色谱鉴别
薄层板：硅胶H—CMC-Na板。
点样：纯化的绞股蓝皂苷乙醇液、人参皂苷Rbl对照品乙醇液。
展开剂：正丁醇-乙酸乙酯-水（4：l：5，上层）。
展开方式：上行展开。
显色：喷5％磷钼酸乙醇液110℃加热显色（约5min）；或喷硫酸-甲醇（1：1）溶液，105℃加热显色。
1.皂苷类成分的结构特征？
2.大孔吸附树脂的操作要点？第七章 汉防己生物碱的提取、分离与鉴定1、掌握一般叔胺生物总碱的提取和纯化方法。
2、熟悉柱色谱法分离生物碱的操作技术。
3、掌握结晶法的一般程序和操作方法。
4、掌握薄层色谱法鉴定己知生物碱的方法。1、回流提取法的操作
2、结晶法的一般程序和操作方法
3、薄层色谱法的操作方法及注意事项
实验十二 汉防已总生物碱的提取
取汉防已粗粉50g，置500ml烧瓶中，加95％乙醇150ml，水溶加热回流提取1小时，倾出乙醇提取液；药渣重新加入95％乙醇100ml，继续如上法加热回流提取1小时，合并两次提取液，过滤，滤液置1000ml广口瓶中。
实验十三 汉防已总生物碱的纯化
将滤液倒置与500ml圆底烧瓶中，水浴回收乙醇(注意加沸石)得流浸膏，倾人蒸发皿中，水浴上挥尽残留乙醇，得到糖浆状提取物。将糖浆状提取物转入500ml烧杯中，缓慢加入0.5％硫酸溶液，边加边搅拌，约加入100ml0.5％H2S04，静置，过滤，得澄明滤液。加氨水调至滤液PH11，立即将其转入500ml的分液漏斗中，加入l00ml氯仿，振摇，静置分层，分出氯仿层，碱水液再加氯仿萃取两次，每次60ml，合并三次氯仿萃取液。在氯仿溶液中加入约10～20克无水硫酸钠，充分振摇2min，静置10min，过滤，滤液置于250ml圆底瓶烧中，回收氯仿至少量，转入20ml蒸发皿中，水浴挥尽残留氯仿。残留物用50ml丙酮分次溶入l00ml圆底烧瓶中，水浴加热回流20分钟，趁热过滤，用少量丙酮洗涤滤纸。回收丙酮至原体积的三分之一，放置过夜，析出深黄色沉淀物，即得汉防已总碱。
实验十四 汉防已甲素和乙素的分离及鉴定
汉防已甲素和乙素的化学结构和性质相似，仅一个官能团的差异，前者为甲氧基，后者为酚羟基，利用两个化合物极性的微小差异，采用氧化铝柱色谱法，可获得满意的分离。
1、装柱 取17×400mm层析柱垂直固定在铁架台上，在管的下端垫人少量棉花．称取氧化铝(100一140目)25克，缓缓加入柱中，边加边轻轻振动色谱柱，使氧化铝在柱中填实均匀。
2、上样 称取汉防已总碱0．5克，置于蒸发皿中，加5ml氯仿溶解，另加氧化铝2克，搅拌均匀，并于水浴上缓缓蒸除溶剂，然后将附有样品的氧化铝装入色谱柱的上端，并盖一圆形滤纸。
3、洗脱 将色谱柱活塞打开，通过分液漏斗缓缓加人氯仿洗脱液。每分钟流速2-3ml，用三角锥瓶收集流份，每个流份收集洗脱液15ml，并依次编号，氯仿洗脱约150ml后，改用甲醇洗脱约50ml。
4、检查 依次将各流份点于硅胶G薄层板上，用氯仿－丙酮－甲醇(6：1：1)为展开剂，展开，挥干溶剂，喷以碘化铋钾试液，比较各流份的Rf值，合并相同Rf值的流份。
1、用回流法提取时要注意什么？
2、用结晶法分离时，溶剂选择有何要求？
3、用柱色谱分离时，汉防已甲素和乙素哪个先出柱，哪个后出柱，为什么？
实验七 黄芩中黄芩苷的提取分离与鉴定
【实训目的】1、能够运用煎煮法、碱溶酸沉法对黄芩中的黄芩苷进行提取和精制。
2、会用显色反应、色谱法进行黄芩苷的检识。【实训原理】 本实验是根据黄芩中的黄芩苷在植物中以镁盐形式存在，可以被沸水溶出，在
【实训目的】
1、能够运用煎煮法、碱溶酸沉法对黄芩中的黄芩苷进行提取和精制。
2、会用显色反应、色谱法进行黄芩苷的检识。
【实训原理】
本实验是根据黄芩中的黄芩苷在植物中以镁盐形式存在，可以被沸水溶出，在酸性（pH1～2）情况下转变成黄芩苷，溶解度降低沉淀析出，从而与共同存在的水溶性杂质分离，进一步精制是利用其钠盐在pH6.5～7时可溶于50％的乙醇，使之与不溶于50％乙醇的杂质分离，在pH1～2时黄芩苷在50％的乙醇中溶解度降低而析出，而得各单体苷元。
【实训材料】
设备：托盘天平、电炉、烧杯、离心机、水浴锅、抽滤装置、量筒、玻璃棒、移液管、脱脂棉、温度计、滴管、pH试纸、新华色谱滤纸（15cm×7cm）、硅胶CMC-Na薄层板、展开缸（筒）、试管、试管架
药品：黄芩粗粉、镁粉、锌粉、5％二氯氧锆、2％三氯化铝、盐酸、40％氢氧化钠、95％乙醇、 冰醋酸、苯、甲酸乙酯、甲酸、正丁醇、冰醋酸、1％三氯化铝、三氯化铁乙醇试剂、1％黄芩标准品三氯甲烷溶液
【操作步骤】
1、黄芩苷的提取
称取黄芩粗粉100g，加10 倍量沸水，并加热煮沸30分钟，随时补充失去的水分，脱脂棉过滤。药渣再加8倍量水煮沸30分钟，过滤。合并两次滤液。加浓盐酸调pH1～2，水浴保温80℃30分钟，放置24小时，析出黄色沉淀。离心滤去沉淀中的水分。将沉淀移入500ml烧杯中，加水100ml，充分搅拌使成为均匀的混悬液，滴加40％氢氧化钠溶液调pH6.5～7，使黄芩苷全部溶解，加入等体积95％乙醇，搅匀后于50℃（水浴保温）迅速抽滤，滤液加热至50℃，以浓盐酸调pH1～2，放置（约4小时）使析出沉淀。倾去上清液，沉淀物抽滤，沉淀用蒸馏水抽洗2～3次，抽干，60℃以下干燥，得粗制黄芩苷。
2、黄芩苷的精制
称取黄芩苷粗品，加10倍量水搅拌均匀，以40%氢氧化钠溶液调pH6.5～7，使黄芩苷全部溶解，加活性炭适量拌匀，加热至80℃30分钟（水浴），抽滤除去活性炭渣，滤液用浓盐酸调pH1～2，加入等体积95%乙醇，50℃保温30分钟（水浴），至有沉淀析出时取