实验7 考马斯亮蓝G-250染色法
测定蛋白质含量
一、目的
1、学习一种蛋白质染色测定的方法
2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具
（一）试剂
1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1ml,5ml）
3、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）标准曲线的制作
1、取7支试管，按下表加入试剂
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定
1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
五、注意事项
1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
六、实验报告
绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。
七、思考题
1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？
2、考马斯亮蓝法有什么优缺点？
第二篇：考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
原理:考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,染料的最大吸收从465nm变为596nm,蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,因此蛋白质测定的灵敏度较高,最低检出量为1ug蛋白质.染料与蛋白质的结合,大约只需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的.一些阳离子乙醇等物质不干扰测定,但去污剂严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除,犹豫染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛用于蛋白质含量的测定.
试剂:1标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数来确定
2蛋白染色剂的配置：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%愚蠢，假如100ml85%磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%磷酸
操作：1.标准曲线的绘制
（1）取7支试管，分别假如0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml标准蛋白质溶液，用水不足到2ml
（2）去8支试管，0号加入0.1ml蒸馏水，1~7号试管一次加入0.1ml步骤（1）的标准蛋白质稀释液，然后各加入5ml蛋白染色剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。
2.样品的测定
去样品溶液0.1ml，用制定标准曲线的方法测595nm光吸度，用标准曲线计算蛋白质的含量。
实验结果
测定所用的标准曲线方程为：v=0．1296x＋0．0907。考马斯亮蓝G-250法测量蛋白质含量与凯氏定氮法相比较误差范围3％～8％。