实验三 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）
一、目的
1.学习一种蛋白质染色测定的方法
2.掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2～5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01～1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、器材与试剂
1.仪器
（1）分析天平；（2）具塞刻度试管10ml×8；（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研钵；（5）漏斗；
（6）离心管10ml；（7）容量瓶10ml；（8）离心机；（9）721型分光光度计
2.试剂
（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料
植物种子
四、操作步骤
1.标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2.样品中蛋白质含量的测定
（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定至刻度。
（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
3.结果处理
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））
六、注意事项
1.由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定
2.测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
3.样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰，可以在做标准曲线时可以用缓冲液代替蒸馏水，就可以将干扰扣除，
七、思考题
1.考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？
2.如何正确使用分光光度计？
八、参考文献
鲁子贤.蛋白质化学.北京:科学出版社,1981
文树基.基础生物化学实验指导.西安:陕西科学技术出版社,1994
张龙翔.生物化学实验技术.北京:人民教育出版社,1981
第二篇：考马斯亮蓝
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、 标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、 蛋白质含量测定方法
1、 凯氏定氮法
2、 双缩脲法
3、 Folin-酚试剂法
4、 紫外吸收法
5、 考马斯亮蓝法
三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
实验六 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）
一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理
考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
（1）分析天平
（2）具塞刻度试管 10ml× 8
（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心管 10ml
（7）容量瓶 10ml
（8）离心机
（9）721型分光光度计
2．试剂
（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料
绿豆芽
四、操作步骤
1．标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定
（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。
（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））
六、注意事项
比色应在出现蓝色2 min～l h内完成。
七、思考题
1．考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？
2．如何正确使用分光光度计？
参考文献
鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981
文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994
张龙翔．生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981