叶绿素的提取和薄层色谱
植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β?胡萝卜素和叶黄素四种。它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。叶绿素的基本结构见图47.1。在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。胡萝卜素有三种异构体，即α?、β?和 γ?胡萝卜素，其中 β?胡萝卜素含量最多，也最为重要。β? 胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A在端链失去两分子水结合而成。在生物体内，β?胡萝卜素受酶催化氧化即形成维生素A。叶黄素(3，3`-二羟基-α-胡萝卜素，lutein，C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡萝卜素。β?胡萝卜素和叶黄素均属于脂溶性化合物。
植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定在植物生理学和农业科学研究中具有重要意义。同时，叶绿素和胡萝卜素等天然色素在食品工业和医药工业中也有广泛的用途。
图12.1 叶绿素a、叶绿素b、β?胡萝卜素、叶黄素
和维生素A的结构式
叶绿素a和b都是吡咯衍生物与金属镁的配合物，尽管它们分子中含有一些极性基团，但大的烷基结构使它们易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂溶剂。β?胡萝卜素和叶黄素是脂溶性的四萜化合物。与胡萝卜素相比，叶黄素易溶于醇而在石油醚中的溶解度较小。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。植物叶绿体色素通常可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有机溶剂提取。
由于粗提取液中还可能包括残余植物组织和其它可溶性杂质，实验中应对粗提液进一步纯化。
薄层色谱是一种较新的分离物质的方法，具有快速、微量、灵敏度高、分离效率好等优点。薄层色谱对天然产物的分离、鉴定更有独到之处，在中草药有效成分的纯化鉴定中广泛应用。 分离叶绿体色素的薄层色谱吸附剂有硅胶、纤维素、聚酰胺、C18等。下面仅介绍常用的硅胶薄层色谱法。本实验通过薄层色谱方式，对植物色素的提取液进一步分离成叶绿素a、叶绿素b、β-胡萝卜素和叶黄素几个组分。
实验仪器与试剂
1.仪器
研钵、量筒、分液漏斗等常用玻璃仪器一套、层析缸、硅胶G板
2.试剂
丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂，饱和氯化钠水溶液，碳酸镁和无水硫酸钠。
实验步骤
1．叶绿体色素的提取
新鲜绿叶蔬菜，如菠菜、空心菜等，洗净后弃除叶柄和中脉，然后用纱布或吸水纸将菜叶表面的水分吸干。称取处理过的菜叶5 g，剪碎后放在干净的研钵内，加入0.1 g碳酸镁，先将菜叶粗捣烂，然后加入10 mL乙醇 - 石油醚（2:3），迅速研磨5 min。用一不锈钢网滤去菜叶残渣，再研磨提取一次。最后再用10 mL乙醇 - 石油醚（2:3）洗涤研钵等容器，一并过滤。
2．粗提取液的纯化
纯化色素时，将合并的滤液转入分液漏斗，加入5 mL饱和的NaCl溶液和45 mL蒸馏水，轻轻振荡，放置分层。小心地把下层的含乙醇水溶液放掉，用洗瓶沿分液漏斗内壁加入50 mL蒸馏水洗涤石油醚层2 ~ 3次，以彻底洗去乙醇或丙酮。每次都要轻轻转动分液漏斗，使叶绿体色素保留在上层的石油醚层中，静置，待分层清楚后，去掉下面的水溶液。再往石油醚色素提取液加入少量无水Na2SO4除去残余水分，转入具塞的棕色瓶中置于暗处保存。
3．叶绿素的薄层色谱
(1)点样
取制备好的薄层板（硅胶G）一块，在板两侧距底边1.5 cm处各做一记号，用玻璃毛细管吸取浓缩的色素石油醚提取液，从距两侧记号1.5 cm处，分别用毛细管点样，斑点不应超过5 mm，晾干。
(2)展开
分离叶绿体色素的展开剂有：石油醚（60 ~ 90℃）-丙酮-乙醚（3:1:1）；石油醚-丙酮（8：2）；石油醚-乙酸乙酯（6:4）；苯-丙酮（7:3）和石油醚（30 ~ 60℃）-丙酮-正丁醇（90:10:4.5）等。
本实验将150 mL石油醚（60 ~ 90℃）-丙酮-乙醚（3:1:1）展开剂倒入层析缸中，并在层析缸的内壁四周贴一张5 cm高的滤纸，滤纸下部浸在展开剂中，盖好盖子平衡10~15 min。将点好样的硅胶板放入展开缸里，液面不能超过点样线，盖好盖子进行上行层析。待展开剂前沿上升到距硅胶板上端1.5~2 cm时，取出硅胶板置于通风橱里晾干，可看到层析板上出现若干色素带，其排列顺序一般是β-胡萝卜素、去镁叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和叶黄素等多条色带。用铅笔标记出样品斑点，计算各色素的比移值Rf。
第二篇：提取叶绿素
实验步骤：
1．叶绿素的提取
▲ 将新鲜菠菜（Spinacia）叶片洗净擦干，去叶柄及叶脉。称取样品8g，剪碎置研
钵内，加入8cm3 丙酮及少许固体碳酸钠，迅速研磨成匀浆；然后再加入20cm3 丙酮充分研磨。 ▲ 在一玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤至已装有20cm3 石油醚
的分液漏斗中，再用少量的丙酮冲洗叶片残渣及研钵，合并滤液。
▲ 沿分液漏斗的壁小心加入40cm3 蒸镏水，轻轻摇动，使色素转移到上面的石油醚层
静置数分钟，待分层清楚后弃去下面的丙酮一一水层。如发生乳化现象可加入2－3cm3 饱和 NaCl 溶液。
▲ 在分液漏中再加入40cm3 蒸镏水，轻轻摇动，以洗去石油醚中残留的丙酮，共洗两
次。然后将叶绿素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用黑纸包好备用。
2．叶绿素理化性质的观察
▲ 光对叶绿素的破坏作用
分别在两支具塞试管中注入2cm3 叶绿素的石油醚提取液，盖紧塞子。一支置暗处，一
支置强光(如太阳光)下，2－3h 后，观察比较两者的变化差异，或在分光光度计的663nm 处 图 17.1 叶绿素分子式
17． 叶绿素的提取及理化性质的鉴定
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比较二者的吸光度值的差异，将结果记录在实验报告中。
▲ 叶绿素的皂化反应
在一支试管中先加入2cm3 叶绿素石油醚提取液，再加入2cm3 新配制的30％ KOH－甲醇 溶液，用力摇动混匀后静置，待分层清楚后观察各层的变化，将观察结果记录在实验报告中。 ▲ 去镁叶绿素的形成
在一支试管中加2cm3 叶绿素石油醚提取液，然后小心加入3cm3 6mol/dm3 HC1，摇动混
匀后静置，待分层后观察各层的变化，记录观察结果。
▲ 铜的取代作用
在一支试管中加入3cm3 叶绿素丙酮提取液，然后加入3cm3 6mol/dm3 HC1，摇匀后再加
入一小块醋酸铜结晶，将试管在水溶中微微加热，观察溶液的颜色变化，记录观察结果。 ▲ 叶绿素的荧光
在一支试管中加入2cm3 叶绿素石油醚提取液，在与入射光(如窗口的自然光)相垂直的
方向观察叶绿素荧光，记录观察结果。
四、方法和步骤
1、叶绿体色素的提取
? 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许 固体碳酸钠或碳酸钙和 10cm 3丙酮，迅速研磨成匀浆，再加 15cm 3丙酮充分研磨提取叶绿素。 ? 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有 15cm 3石油醚的分液漏斗 中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。
? 沿分液漏斗的壁小心加入 30cm 3蒸馏水，轻轻转动加入4 -8cm 3饱和NaCL水溶液，静止几分钟 待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。再加入 30cm 3蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油 醚中残留的丙酮，弃去水层。共洗两次。将色素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用 黑纸包好备用。
2、叶绿素理化性质的观察
? 光对叶绿素的破坏作用，在 2支具塞试管中各放入 2cm 3上述色素石油醚提取液，盖好塞子。一
支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经2—3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变 化，或在分光光度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。
? 叶绿素的荧光，取 2cm 3上述色素的石油醚提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂 直的方向观察叶绿素暗红色的荧光。
? 叶绿素的皂化反应，取 1 -2cm 3上述色素的石油醚提取液一试管中，逐步加入2 -5cm 3新配制的 30% 3KOH-甲醇溶液，用力振动试管后静止分层，观察上下层溶液的变化。
? 去镁叶绿素的形成，取 1 -2cm 3上述石油醚提取液放入试管中，小心加入 3cm 36mol/dm3HCL， 摇动后静止分层观察溶液颜色变化。
? 铜的取代作用，取 1 -2cm 3色素的丙酮提取液于试管中，加入 3cm 36mol/dm3HCL，摇动试管，再逐步加入醋酸铜结晶（把试管放进水浴中微微加热），可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色，说明铜取代了氢占据在镁在叶绿素中的位置。
在实验中加入少许二氧化硅的目的是为了研磨充分。加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用
防止叶绿素的变化
叶绿素是一种天然色素，对光热、酸碱等比较敏感。因此，在加工或贮藏过程中常易褪色或变色，对蔬菜成品感官质量影响巨大。叶绿素的防护：
①碱处理。将蔬菜在0.01%的氢氧化钠等稀碱溶液中浸泡20分钟-30分钟，叶绿素生成叶绿酸盐、叶绿醇等，颜色仍为鲜绿色。但这种方法保绿时间不太长，会导致营养成分的严重损失。
②用铜或锌取代叶绿素中的镁。可选用醋酸铜、硫酸锌溶液，浓度以0.1315%最好，ph值为9，浸泡30分钟。生成铜和锌的衍生物可以长期保持绿色。铜比锌活性高，取代反应速度快，但铜的残留量受质量标准限制，而锌的安全性较高，护绿效果也不差，成本也较低，可优先考虑使用锌制剂来保护蔬菜的绿色。