吉林化工学院
食品分析实验报告
实验名称 蛋白质含量的测定
指导教师 陈 萍
班 级 食 品 0901
学 号 09340136
姓 名 黄 锡 红
日 期 2012.11.28
蛋白质含量的测定
一、目的与要求：
掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消
化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。
二、原理：
凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。
( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2
(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4
(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O
(4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2
三、试剂与仪器：
1、硫酸钾
2、硫酸铜
3、硫酸
4、2％硼酸溶液
5、40％氢氧化钠溶液
6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．
7、约0．01mol/L硫酸标准溶液．
8、KDN-08A(04A)定氮仪
9、三角瓶250ml 3只。
10、量筒50ml、l0ml、l00ml。
11、吸量管10ml只。
12、酸式滴定管1支。
13、容量瓶100毫升1只。
14、小漏斗1只。
四、实验步骤
1.样品处理： 移取5ml牛奶，移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅（选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，1h左右后可满电压工作）。待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。
2.蒸馏： (KDN-08A为例)蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH ，H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定。
向接收瓶内加入50ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液于定氮瓶中，加入10ml 40%氢氧化钠溶液，开始蒸馏，在接收瓶内接收液达150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。
3.滴定： 取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
4.硫酸标准溶液的标定： 称取固体碳酸钠0.2232g于烧杯中加少量水溶解，溶解后移入250ml容量瓶中，定容，摇匀。再分别移取25ml碳酸钠溶液三分于100ml锥形瓶中，各加入两滴指示剂。用标准硫酸溶液滴定到颜色由淡红色变成灰色即为滴定终点，记录硫酸溶液消耗的体积。
四、数据记录
实验数据表1-1
五、计算
1.标准硫酸溶液浓度计算
1 1
CV m/M
由表1-1数据可算出硫酸浓度(由于称量时，碳酸钠质量扩大了10倍，所以计算时需缩小10倍，所以下列式中“10”表示10倍)
同理：
为0.01172 mol/l，
为0.01170 mol/l
mol/l(1mol/l=1N)
2. 样品中蛋白质的含量计算
公式:
X：样品中蛋白质的含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。
即每毫升样品中蛋白质含量为1.91g
六、结果讨论
相对于其他的蛋白质含量测定法，凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以订单发测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。从实验结果测得的实际数据和包装盒上厂家所给数据，可以清晰知道，蒙牛和光明纯牛奶的蛋白质含量是没有虚假上报的，而伊利纯牛奶的蛋白质含量没有包装盒上所给的高。可能是测定的时候有一些实验操作过程所造成的误差。所以可以通过别的测定蛋白质的含量的方法进行进一步鉴定。或者再次使用凯氏定氮法测一次伊利牛奶的蛋白质含量。以得到更加准确可靠的结果。
七、注意事项
（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样 品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。
（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。
（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
（8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9）吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++
八、思考题
1.本实验的误差来源有哪些？
答: 凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源可能是样品、催化剂种类和用量、消化的时间、加碱液后的操作、蒸馏加热、清洗凯氏定氮仪的过程、凯氏定氮仪的气密性、氨气是否完全蒸馏出来；硼酸是否封住蒸馏管口、试剂的准确性、滴定终点的判断、滴定盐酸的浓度准确性等。
2. 试验中加入硫酸钾和硫酸铜混合物的作用是什么？
在硫酸消解液中，硫酸钾的作用是提高硫酸的沸点以提高消解温度；硫酸铜是催化剂，其作用是加快消解速度，二者的共同作用是缩短消解时间，减少消解过程中氨的逸失
九、评语和成绩
成绩： 指导教师：
第二篇：Lowry氏法测定蛋白质含量
