植物蛋白质含量的测定

一、原理

查询资料，得知玉米蛋白质含量较高。再经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后，得可溶性蛋白质于上清液中，将沉淀用碱水解则得到非可溶性蛋白质的提取液，将提取液与卡马斯亮蓝溶液反应呈蓝色，在595nm处有最大吸收峰。在一定范围内，蛋白质含量与反应液在595nm波光的吸收度呈正比，由此可求出蛋白质的含量

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：玉米粒

（二）仪器设备：

分光光度计； 离心机； 恒温水浴； 研钵； 离心管； 刻度移液管；微量滴定管； 试管等

（三）试剂：

100μg／ml牛血清标准蛋白质溶液；0.15mol/L NaCl; 1mol/LNaOH;50mmol/L Tris-HCl提取液、卡马斯亮蓝溶液

三、实验步骤

（一）标准曲线的绘制

编号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白（ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Tris-HCl提取液(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 卡马斯亮蓝溶液(ml) 5 5 5 5 5 5 每管牛血清蛋白含量(ml) 0 20 40 60 80 100

加入表中的试剂，摇匀，室温放置4分钟，以不加标准蛋白的0号管为空白，在595nm波长处测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定

称取鲜样0.5g，加提取液6ml，研磨成匀浆后，在10000r/min,4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。沉淀加3ml1mol/L NaOH溶液，在90℃恒温水浴锅中加热20min，在4000r/min，4℃条件下离心10min，上清液为非可溶性蛋白质提取液。取上清液各0.1ml，分别加入Tris-HCl提取液0.9ml，然后再分别加入卡马斯亮蓝溶液5ml，摇匀，于595nm波长处测定吸光值。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

四、结果计算：

样品中蛋白的含量（μg/g）＝查标准曲线值（μg）×提取液总体积（ml）/(样品鲜重（g）×测定时加样量（ml）)

粗蛋白量（％）＝蛋白氮含量×6.2

第二篇：实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。 【试剂】

（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月； （3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。 【方法】 1.标准曲线的绘制

（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液

管 号

100μg/ml牛血清蛋白量(ml)

蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg)

1

2

3

4

5 0.8 0.2 0.08

6

1.0 0

0.2

0.8 0.02

0.4

0.6 0.04

0.6

0.4 0.06

1.0

0 0.10

（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

管 号

1000μg/ml牛血清白蛋白（ml）

蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg)

7 0 1.0 0

8 0.2 0.8 0.2

9 0.4 0.6 0.4

10 0.6 0.4 0.6

11 0.8 0.2 0.8

12 1.0 0 1.0

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3.结果计算

C?

V

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=W

式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。

二、LOWRY法

【原理】

Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。