设计型实验——菠菜中草酸含量的测定

一、实验目的

通过菠菜中草酸含量的测定实验，充分发挥学生学习的主动性和创造性，加深课堂知识理解，拓宽知识面，培养学生创新能力和独立解决问题的综合能力。

二、总体要求

1. 围绕教师给定的实验题目，查阅有关参考资料，了解试样的组成

2. 学生自己设计实验方案，要求采用分光光度法测定。

3. 合理安排实验进程，要求学生按方案自行准备仪器，采集试样，

配制试剂等。实验过程中如实记录实验数据。

4. 实验结束后及时书写实验报告，上交任课教师。

三、对实验方案的要求

1. 认真查阅有关参考资料，了解试样的组成，待测组分的性质和大

致含量，干扰组分及大约存在量。

2. 分析方法确定后，写出较详细的实验方案，包括分析方法、基本

原理、所用仪器和试剂、具体实验步骤（包括试样的处理、标准溶液的配制和标定、实验条件、待测组分的测定等）、实验结果的计算公式。

四、对实验报告的要求

按照所拟订的实验方案认真细致的进行实验，做好实验数据的记录，在实验过程中，发现原实验方案有不完善的地方，应予以改进和完善。

实验结束后，按照实验的实际做法，及时认真地书写实验报告，报告格式包括实验目的、基本原理、试剂、实验步骤、数据记录及处理、问题讨论。

五、时间安排

第九周：查阅资料，确定方法，拟订实验方案

第十周星期二第三大节：对各种方法进行点评，学生分组采集试样、准备仪器及配制试剂。

第十一周：独自完成试样中草酸含量的测定，书写实验报告。

第二篇：从菠菜中提取草酸及其含量的测定

216 2009, Vol. 30, No. 16食品科学※分析检测

蔬菜中不同形态草酸的提取测定

曾 芳，刘忠珍，许桂芝，王荣辉，欧 俊

(广东省农业科学院土壤肥料研究所，广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室，广东 广州 510640)摘 要：采用离子色谱法研究不同温度和盐酸加入量对菠菜、苋菜、芫荽、韭菜4种蔬菜水溶性草酸和总草酸提取测定的影响。水溶性草酸用不同温度的水溶液提取，总草酸用不同量的0.5mol/L HCl浸提，离心稀释过滤后上机测定。菠菜和苋菜的水溶性草酸随提取温度的升高而增大，总草酸含量在0.5～2ml 0.5mol/L HCl范围内随盐酸加入量的增加而增大；而芫荽和韭菜的水溶性草酸和总草酸含量随提取温度和盐酸加入量的变化不大。采用2ml0.5mol/L HCl浸提总草酸，用沸水浴20min浸提水溶性草酸，适用于不同类型蔬菜样品草酸的提取测定。4种蔬菜中草酸的加标回收率在95.5%～103.5%之间，水溶性草酸和总草酸含量顺序均为菠菜＞苋菜＞韭菜＞芫荽。该方法具有操作简便、干扰小、灵敏、回收率高等特点，适用于蔬菜不同形态草酸的提取测定。

关键词：蔬菜；草酸；提取；离子色谱

Extraction and Determination of Different Forms of Oxalate in Vegetables

ZENG Fang，LIU Zhong-zhen，XU Gui-zhi，WANG Rong-hui，OU Jun

(Soil and Fertilizer Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Key Laboratory of Nutrient Resource Cycling

and Farmland Conservation, Guangzhou 510640, China)

Abstract ：The effects of temperature and amount of added HCl on the extraction of water-soluble oxalate and total oxalate fromfour vegetables (spinach, amaranth, coriander and Chinese chive) were investigated by ion chromatographic method. The water-soluble oxalate was extracted using water at different temperatures, and total oxalate was extracted using different amounts of0.5 mol/L HCl solution. The centrifugation supernatant of extracts were supernatant diluted and filtrated well enough prior to ionchromatographic detection of oxalate. The water-soluble oxalate contents of spinach and amaranth increased with the increaseof temperature, and their total oxalate contents increased with the increase of addition amount of 0.5 mol/L HCl in the rangeof 0.5－2 ml. While no significant changes in both the two forms of oxalate in Chinese chive and coriander were found whentemperature and HCl addition amount were changed. The best extraction efficiency was obtained when total and water-solubleoxalates were extracted using 2 ml of 0.5 mol/L HCl and boiled water for 20 min respectively. The recoveries of water-soluble andtotal oxalate in the four vegetables were between 95.5％ and 103.5％, and the contents of total and water-soluble oxalates bothdecreased in the following order: spinach > amaranth > Chinese chive > coriander. This method is easy to operate, with littleinterference as well as high sensitivity and recovery and therefore is applicable to the determination of different forms of oxalatein various vegetables.

Key words：vegetable；oxalate；extraction；ion chromatography

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)16-0216-04草酸是植物体内普遍存在的一种二元羧酸，主要以

游离态(草酸钠和草酸钾)和草酸钙结晶的形式存在，不

同科属植物的草酸含量差异很大。从环境毒理学和食品

营养学的角度看，草酸是一种环境毒素和抗营养因子，

长期食用草酸含量高的蔬菜容易引发关节炎、低血钙、

膀胱结石和肾结石等疾病[1-5]。另一方面，草酸在钝化重金属和增强植物抗逆性等方面起着重要的作用，是植物体内环境胁迫的响应因子，参与钙离子和pH值调节[6-9]。利用化学法或仪器分析法可以定量分析测定植物水溶性草酸和总草酸含量，总草酸和水溶性草酸的差值为难溶性草酸。水溶性草酸较易被人体吸收，进入体液循环系统，与人类健康关系较为密切，测定总草酸含量可收稿日期：2008-09-23

基金项目：广东省农业科学院土壤肥料研究所所长基金项目(2008-szjj-03)

作者简介：曾芳(1982－)，女，硕士，研究方向为色谱分析。E-mail：zfang408@163.com

※分析检测食品科学

2009, Vol. 30, No. 16217

为研究植物代谢生理提供重要信息。目前草酸的测定方法主要有容量法、比色法和色谱分析法[1,10-12]等，其中色谱分析法的灵敏度、检测限和回收率等指标均优于传统方法。已有研究利用液相或离子色谱分析大豆、茶叶、甘草等植物的草酸含量[12-14]，但对于蔬菜中水溶性草酸和总草酸的提取条件和影响因素的报道尚少。

本实验以菠菜(Spinacia oleracea L.)、苋菜(Amaranthusmangostanus L.)、芫荽(Coriandrum sativum L.)、韭菜(Allium odorum L.) 4种不同科属的蔬菜为材料，利用离子色谱法测定它们的水溶性草酸和总草酸含量，比较不同提取温度和盐酸浓度对水溶性草酸和总草酸测定的影响，以期为蔬菜品质分析测定提供方法依据。1材料与方法1.1

材料与试剂

菠菜(藜科)、苋菜(苋科)、芫荽(伞形科)和韭菜(百合科)新鲜样品，测试当天购自农贸市场。

氯化钠、硝酸钾、硫酸钾、草酸钠(优级纯) 天津科密欧科技有限公司；氢氧化钠、盐酸(分析纯) 广

州化学试剂厂；超纯水。1.2

仪器与设备

DX-120型离子色谱仪[配电导检测器，ASRS 300(4mm)自再生抑制器，HW-2000色谱工作站] 美国戴安公司；3K15离心机 Sigma公司；组织匀浆机；Milli-Q超纯水机；水浴锅。1.3方法1.3.1

样品预处理

将新鲜的蔬菜样品洗净晾干，取200g剪碎混匀的样品，加入150ml水，放入组织匀浆机中匀浆，用50ml水冲洗，冲洗液并入匀浆液混匀备用。称取2.0g匀浆液进行蔬菜草酸含量的测定。测定总草酸含量是加入一定量的HCl溶液浸提20min，然后用水定容至100ml。测定水溶性草酸是直接加水至50ml左右，水浴浸提，冷却后定容至100ml。经10000r/min离心10min，澄清，稀释(5～20倍)，过0.45μm滤膜后上机测定。1.3.2

色谱条件

IonPac AS11阴离子柱(4mm×250mm)，IonPac AG11保护柱，抑制电流：50mA；淋洗液：12mmol/L NaOH；流速：1.0ml/min；进样量：25μl。1.3.3

标准曲线的绘制及检测限、重现性的测定草酸的定量分析采用外标法进行，用草酸钠作为基准试剂，配制0～30μg/ml的标准系列，测定不同浓度的草酸标准溶液的峰面积，回归分析得草酸的标准曲线。1.3.4

不同盐酸加入量对蔬菜总草酸提取测定的影响植物体内的草酸主要以游离态和草酸钙结晶的形式存在，通常将用盐酸提取的草酸称为总草酸，用水浸提的草酸称为水溶性草酸，总草酸和水溶性草酸的差值为难溶性草酸。传统的高锰酸钾容量法中总草酸含量的测定使用3ml 6mol/L HCl浸提[15]，而用离子色谱法测定时，使用高浓度的盐酸浸提，会造成待测液中含有大量的氯离子，过高的氯离子浓度易引起阴离子柱过载，降低柱效。因此，在不影响总草酸提取效果的前提下，盐酸浓度越低越好。在4种蔬菜中加入0.5、1、2、4ml浓度为0.5mol/L的HCl，考察盐酸加入量对总草酸提取测定的影响。1.3.5

加标回收实验

用2ml 0.5mol/L HCl在沸水浴浸提20min的处理条件下作水溶性草酸加标回收实验。2结果与分析

2.1

草酸根与其他阴离子的分离图谱

7

6NO3

SO4

2

5C2O4

2

)

4(μSCl－导3电210

－12

2.533.544.55

保留时间(min)图1 阴离子标准谱图

Fig.1 Chromatogram of standard anions

如图1所示，草酸根与其他阴离子的分离较好，不受干扰，草酸根的出峰时间约为4.4min，蔬菜样品的草酸分离图谱见图2。

3.54

C2O4

2

)

2.53(μS导1.52电0.51－0.5022.533.544.55

－1

保留时间(min)图2 样品分离谱图

Fig.2 Chromatogram of vegetable sample

2.2标准曲线的绘制及检测限、重现性的测定结果经测定草酸标准曲线为y = 6687.05x－27.36。在0～

30μg/ml的范围内，草酸根浓度和峰面积呈显著正相关(r=0.9998，n=18，P＜0.0001)，可用于草酸的定量分析。通过分析不同浓度标准溶液信号和噪音的比值，得到草酸的检测限为0.05μg/ml(S/N=3)，重复测定11次的变异系数为1.8%。2.3

不同盐酸加入量对蔬菜总草酸提取测定的影响

218 2009, Vol. 30, No. 16

食品科学

表3 不同形态草酸含量和回收率结果

Table 3 Results of different forms of oxalate contends and recovery

※分析检测

项目植株含量(mg/kg)加标量(mg/kg)测定值(mg/kg) 总草酸

菠菜7517.0±51.9

20009437.0±159.0

苋菜6209.6±72.4

20008186.4±52.0

韭菜510.4±5.9

5001028.1±7.4

芫荽440.1±3.5

500942.9±4.4菠菜

水溶性草酸

苋菜1616.0±14.1

5002093.3±3.4

韭菜469.1±5.9

250726.9±26.2

芫荽370.4±6.1

500854.3±26.7

3844.0±58.6

20005830.6±79.8

回收率(%)

96.0

98.8

103.5

对于菠菜和苋菜，总草酸测定值随HCl加入量的增加而增大，加入2ml和4ml的处理差异不大。但对于芫荽和韭菜，HCl加入量对总草酸提取效果影响不明显(表1)。故对于不同草酸含量的蔬菜来说，选择2ml 0.5mol/LHCl提取总草酸具有较高的通用性。

表1 不同盐酸加入量对总草酸提取测定的影响(mg/kg FW)Table 1 Effects of different addition amount of hydrochloric acid

on the total oxalate (mg/kg FW)

HCl加入量(ml)

菠菜

苋菜

韭菜

芫荽

0.56439.6 ± 51.5 2956.2 ± 104.1509.6 ± 4.2436.1 ± 5.217004.5 ± 109.45062.0 ± 52.9512.0 ± 8.4439.2 ± 3.827517.0 ± 51.96209.6 ± 72.4510.4 ± 5.9440.1 ± 3.54

7524.7 ± 40.9

6201.5 ± 72.4509.0 ± 4.3438.6 ± 4.8

2.4不同提取温度和浸提时间对蔬菜总草酸和水溶性草酸提取效果的影响

设计了30℃水浴、60℃水浴和沸水浴3种条件处

理提取总草酸和水溶性草酸的对比实验。结果表明，用2ml 0.5mol/L HCl浸提测定4种蔬菜总草酸含量时，温度对总草酸的提取效果影响不大。不同种类蔬菜中水溶性草酸的提取效果受温度影响有差异，本研究中菠菜和苋菜水溶性草酸的提取效果随处理温度的升高而增大，而芫荽和韭菜水溶性草酸的含量随温度的升高变化不大(表2)。不同沸水浴提取时间(20、40、60min)对水溶性草酸的提取效果影响不大，故提取不同类型蔬菜的水溶性草酸时，选择加入2ml HCl在沸水浴浸提20min即可。

表2 不同提取温度对水溶性草酸的影响(mg/kg FW)Table 2 Effects of different extract temperature on the water-soluble oxalate (mg/kg FW)

水浴条件

菠菜

苋菜韭菜芫荽30℃水浴3525.1±11.71394.6 ± 12.5469.1 ± 5.9370.8 ± 5.660℃水浴3563.1±24.71492.7 ± 7.1

476.4 ± 6.5374.6 ±12.8沸水浴

3844.0±58.61616.0 ±14.1

474.9± 9.2

370.4 ± 6.1

2.5蔬菜中不同形态草酸含量及回收率的测定4种蔬菜总草酸、水溶性草酸含量和回收率结果如

表3所示，总草酸和水溶性草酸的含量均为菠菜＞苋菜＞韭菜＞芫荽。菠菜和苋菜中难溶态草酸占总草酸的百

100.5

99.3

95.5

100.8

96.8

分比较高，各为48.9%和74.0%，而韭菜和芫荽中的草酸主要以水溶态形式存在，难溶性草酸各占总草酸含量的8.1%、15.8%。难溶性草酸主要以草酸钙结晶存在，草酸钙的溶解度很小，在18℃时只有6mg/L[2]，其溶解度会随着温度的升高而增大。菠菜和苋菜的难溶性草酸比例较高，当提取温度升高时，有部分草酸钙结晶转化为水可提取态的水溶性草酸，故温度对这两种蔬菜的水溶性草酸提取影响较大。同样，较高的酸度也会促进草酸钙结晶的溶解，故总草酸的提取也受HCl加入量的影响。但对于韭菜和芫荽，其难溶态草酸占总草酸的百分比较低，温度和提取液的酸度对草酸钙转化溶解的影响较小，提取温度对这两种蔬菜的水溶性草酸提取效果影响不大，盐酸加入量对总草酸的提取效果影响也很小。即蔬菜中草酸的提取效果主要受难溶性草酸影响。4种类型蔬菜水溶性草酸和总草酸的不同加标回收率在95.5%～103.5%之间。因此，2ml 0.5mol/L HCl 浸提总草酸，沸水浴20min浸提水溶性草酸的提取条件具有普适性和较高的回收率。3

结 论

采用IonPac AS11阴离子柱，电导检测器，以12mmol/L NaOH 为淋洗液，可有效分离和定量分析蔬菜中的水溶性草酸和总草酸。蔬菜草酸的提取测定主要受难溶性草酸的影响，难溶性草酸占总草酸百分比较高的蔬菜(如大于40%)，其水溶性草酸随水浴浸提温度的升高而增大，总草酸含量在HCl加入量低于2.0ml时随HCl加入量的增加而增大。采用2ml 0.5mol/L HCl浸提总草酸，用沸水浴20min浸提水溶性草酸，适用于各种蔬菜样品中草酸的提取测定。采用该方法对菠菜、苋菜、芫菜、韭菜进行测定，其加标回收率在95.5%～103.5%之间，水溶性草酸和总草酸含量顺序均为菠菜＞苋菜＞韭菜＞芫菜。本方法具有操作简便、干扰小、灵敏、回收率高等特点，可作为蔬菜不同形态草酸含量测定的分析方法。

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