酶促反应动力学综合实验
实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定
【目的要求】
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。
【实验原理】
1、碱性磷酸酶：
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取。
2、米氏方程：
Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：
(1)
式中：v表示酶促反应速度，
表示酶促反应最大速度，
[S]表示底物浓度，
表示米氏常数。
3、 值的测定主要采用图解法，有以下四种：
①双曲线作图法（图1-1，a）
根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2
时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测
一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
② Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）
实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线行驶，测定要方便、精确地多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：
(2)
以
对
作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为
，纵截距为
。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—
。
③Hofstee作图法（略）
把（2）式等号两边乘以
，得：
(3)
以v对
作图，这时斜率为
，纵截距为，横截距为
。
④Hanas作图法（略）
把（2）式等号两边乘以[S],得：
(4)
以v对
作图，这时斜率为
，纵截距为
。
（a） (b)
本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：
然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
【仪器与试剂】
仪器：
1. 恒温水浴
2. 721型分光光度计
试剂：
1．酚试剂：称钨酸钠（
W
·2
O）100g，钼酸钠（Mo·2O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。
2．2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2?2H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，加数滴氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。
3．碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.
4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。
【实验步骤】
取6支试管按下表加入试剂：
以6管为调零点，在620nm波长处比色。
【结果处理】
1 将各管光密度和底物浓度记入下表
2以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver- Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。
【注意事项】
1） 加入碱性磷酸酶的量要准确
2） 保温时间要准确
提供方法：如从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液,直至加完，到准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温13分钟。
【思考题】（待定）
1） Km 的意义
2） 为什么酶促反应速度以初速度表示
3）为什么O.D可直接代替V作图
4）分析自己的实验数据
实验（二）——温度对酶活性的影响
【实验目的】
了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】
每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。
【仪器与试剂】
仪器：
1．冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架
4．吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管
7．烧杯
试剂：
1． PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即可。
2．0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。
3．0．03175g/L碘液
4．1M HCl溶液 5.1M NaOH溶液 6.稀释100倍的唾液
【实验步骤】
1．制管和预温
实验开始时，并不是将下表三种试剂直接混合加入同一试管，而是每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A管和B管。A管加入PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5min。
取12支洁净试管，参照下表加入试剂：
*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替
2．混合A、B管
将一号A管试剂迅速加入温度对应的B管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。这一步应注意：转移A管试剂前需将其摇匀。
3．时间控制
然后每隔1min或2min（时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合 ，控制好时间。
4．中止反应
准确反应13min，向1号管加入2滴1M HCl溶液，立即混匀，中止反应，按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。后再各用2滴1M NaOH溶液中和每管。
5．显色
在每管中各加入2ml 0.03175g/L碘液并混匀，观察现象。
6．比色
若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较。
【结果处理】
记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。
【注意事项】
【思考题】
实验（三）——PH对酶活性的影响
【实验目的】
了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】
【仪器与试剂】
仪器：
1、冰箱 2、电炉 3、恒温水浴锅 4、试管架及试管
5、移液管架及移液管
试剂：
1、0.2M磷酸氢二钠溶液：称取35.61g含2个结晶水的磷酸氢二钠，用水定容至1L。
2、0.1M柠檬酸溶液：称取21.01g含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。
3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释10倍、50倍和100倍，得三种不同浓度的酶液、
4、0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。
5、0.1%淀粉液：0.1g可溶性淀粉，加到100ml蒸馏水中，加热溶解。
6、碘液：15g碘化钾和12.7g碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释至200ml。
7、1%氯化钠溶液。
8、0.1%硫酸铜溶液。
【实验步骤】
（一）PH对酶活性的影响
1、缓冲溶液的配制
表23-1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制
取六支洁净试管，编号后按表23-2操作：
表23-2 pH对酶活性的影响
【结果处理】
记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。
【注意事项】
【思考题】
实验（四）——酶浓度对酶活性的影响
【实验目的】
了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】
在适宜的条件下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，反应速度随酶浓度增加而增加，两者间成正比。
本实验采用唾液淀粉酶为例。加入不同浓度的酶，并比较在同一适当时间后，以碘检验淀粉的含量从而确认其反应程度。
【仪器与试剂】
仪器：
1.恒温水浴锅
2.吸量管
3.试管与试管架
试剂：
1.含NaCI的0.5%淀粉液
2.pH7.0的缓冲液
3.分别稀释过10、50和100后的唾液
【实验步骤】
1.取3支洁净试管，按下表加入淀粉液，缓冲液，加毕后放入37度恒温水浴中保温5分钟；
2.保温后，快速加入不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入37度恒温水浴中，并计时。约3至4分钟后加入稀释后等量的碘液一至两滴，立即摇匀后，记录各管的颜色。
【结果处理】
记录现象，做出合理分析。
【注意事项】
【思考题】
实验（五）——离子对酶活性的影响
【实验目的】
了解离子对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】
酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，如Br-、NO3-和I- 对该酶也有激活作用，但较微弱。而Cu2+对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。
就本实验，低浓度CI-可以增加酶活性，高浓度的CI-或者低浓度的Cu2+则会抑制酶活性，同时低浓度的Na+、SO42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可以直接作为酶活性中心的构成部分。
【仪器与试剂】
仪器：
1.恒温水浴锅
2.吸量管
3.试管与试管架
试剂：
1. 1%NaCI溶液
2. 0.1%CuSO4溶液
3. 0.1%淀粉液
4. 100倍稀释唾液、5.碘液
【实验步骤】
取3支洁净的试管，编号后按下表操作：
【结果处理】
记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。
【注意事项】
【思考题】
为什么加入淀粉后有试管内颜色显现为红色？
（思考题可以总结起来出在最后面）
第二篇：实验五 酶促反应动力学实验
实验五 酶促反应动力学实验
——温度和离子对酶活性的影响
【实验目的】
1、了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
2、了解离子对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。
【实验原理】
1、每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。
2、酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，如Br-、NO3-和I- 对该酶也有激活作用，但较微弱。而Cu2+对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。
就本实验，低浓度CI-可以增加酶活性，高浓度的CI-或者低浓度的Cu2+则会抑制酶活性，同时低浓度的Na+、SO42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可以直接作为酶活性中心的构成部分。
【实验用品】
1、仪器和器材：冰箱、恒温水浴锅、紫外分光光度计、试管和试管架、移液枪及枪头、胶头滴管、烧杯
2、试剂：1)PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即可。
2)0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml蒸馏水（需加热）。
3)碘液
4)1M HCl溶液
5)1M NaOH溶液
6)稀释100倍的唾液
7)冰水浴
8) 1%NaCI溶液
9) 0.1%CuSO4溶液
10)0.1%淀粉液
【实验内容】
（一）温度对酶活性的影响
1．制管和预温：
由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A管和B管，同时欲温底物与酶。A管加入PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5min。
取12支洁净试管，参照下表加入试剂：
*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替
2．混合A、B管：
将1号A管试剂迅速加入温度对应的B管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。
3．时间控制
然后每隔1min或2min（时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合 ，严格控制好时间。
4．中止反应
准确反应13min，向1号管加入2滴1M HCl溶液，立即混匀，中止反应，按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。后再各用2滴1M NaOH溶液中和每管。
5．显色
在每管中各加入2ml 0.03175g/L碘液并混匀，观察现象。
6．比色
若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较。
（二）离子对酶活性的影响
取3支洁净的试管，编号后按下表操作：
【结果处理】
记录现象（或比较吸光度值），做出合理分析。
【注意事项】
严格注意时间的控制及各物质的添加量。
【思考题】
1、如果某同学（没有严格按照教案步骤）做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度为70度，请分析他得出这样的结果的可能原因。
2、为什么加入淀粉后有试管内颜色显现为红色？