酶联免疫吸附试验室内质控的几个问题
临床实验室质量管理的第一要素是选择和执行适当的室内质量控制(internal quality control,IQC)程序，例如依据测定项目的质量要求和方法特点选择统计学标准、控制规则和质控品的数目，并严格执行IQC程序以提高IQC的质量。室内质控方法很多，但酶联免疫吸附测定(ELISA)中仍主要采用Levey-Jennings质控图。笔者长期从事免疫学检验质量管理工作。发现医院、血站检验科在实际工作中存在一些比较普遍的问题或疑问。根据自身实践经验，结合相关专著，简要介绍如下，供实验室参考。
1.质控品准准备
1.1 质控品浓度 以需要质控的点设值进行质控，般在Cut-of值(即CO值，是由试剂盒提供的公式计算出的阴、阳性判断标准)附近选点。建议选点方法。选择S/CO值减去精密度测定中得到的3倍批间CV与S/CO值的乘积(意即3倍s)仍大于1的质控血清作为判断实验室重复性的室内质控点。
1.2 购买质控品建议用户购买质控品进行室内质量控制，这样的质控品的稳定性更有保证。主要项目在卫生部临床检验中心都有长期供应(北京东单大华路1号北京医院内卫生部临床检验中心免疫质量控制室，邮编：1O0730)
1.3 自制质控品的制备方法 (1)收集阳性血清(无明显溶血、黄疽、脂血或污染血清)，累积到一定数量(够本室使用6月以上)；(2)混匀，经56℃ lO小时灭活，(3)离心或过滤，去除纤维沉淀物(4)用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释．使S/CO值达到2～4之间(5)与定值参考品进行对比，求测定值(6)将质控血清按0.2～O.5毫升/支分装、封口、贴签，置-2O℃保存。
2.如何正确应用“即刻法”进行质控不能随意使用“即刻法”，以下情况下可使用：(1)实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELISA试剂盒效期短．用一批号试剂盒连续常规检测2O次以获得RCV数据难度较大。采用“即刻法”质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控；(2)在某一检测项目开始准备开展Levey-Jennings室内质控，尚未完成RCV测定时使用，其目的是尽早启动室内质控，在开展lI缶床实验的同时进行RCV测定，以便在获取足够数据后转入Levey-Jennings室内质控。由于数据量小，质控规则单一，“即刻法”质控方法可靠性相对较差。在使用该质控方法时，务必加强实验全程监控以保证质量，并在获取足够数据后及时转入Levey-Jennings室内质控。实验室需要更换质控品批号时，应提前开始下一批号质控品RCV靶值和标准差的测定，尽量避免使用“即刻法”质控方法。
3.质控规则的选择
一般以x靶±2s为警告限，以x靶士3s为失控限(这是公认的判断实验结果是否失控的原则)，获得“常规实验室质量控制图”空图。每次(或每天)随患者样本测定的质控物值，标记在质控图上。分析质控图中每天检测质控标本的结果分布，判断当天检测的结果数值是否在控制限之内。各实验室选择失控限时，应根据本室条件进行选定。失控限定得太宽，几乎不必担心有失控可能，这样常将失控结果误判为合格，使质控失去意义；相反，失控限定得太严，使太多的结果甚至合格的结果判为失控，这也使质控失去意义。依据本室条件，设定失控限，是室内质控重要的环节。Westgard多规则质控分析法：在质控图中，单纯依据质控点超出2s为警告，超出3s为失控，在临床检验中已显不够。Westgard将常用的判断失控的规则总结出许多条规则，选择质控规则时必须兼顾室内质控对失控的检出能力及误判失控的可能性。在免疫学检验质控中，建议实验室选择使用以下
几种质控规则：(1)13s:1个质控点落在士3s之外；(2)R4s：连续2个质控点相差超出4s范围；(3)41s:连续4个质控点落在同一侧士1s之外；(4)7x靶：连续7个质控点落在均值之一侧；(5)7t：连续7个质控点呈连续上升或下降，或周期性波动变化。质控规则还有很多，各实验室可依据自己的实际情况选择质控规则。
4．更换试剂批号的处理方式
由于ELIsA试剂的效期相对较短，而在冷冻条件下，免疫质控血清效期相对较长，一个批号的质控血清往往要几个批号的试剂才会用完，因此实验中常会遇到更换试剂批号后如何处理质控图的问题。更换不同厂家的试剂必须重新计算RCV(最好在更换前完成RCV的测定，以免中断室内质控)。更换相同厂家不同批号的试剂，使用质控血清浓度值上下相邻的系列质控血清验证新批号试剂S/CO值的一致性。推荐对不同批号试剂间系列血清结果回归方程进行比较，以获得两批试剂间的换算因子，可以在同一质控图上继续描点。当换算因子为1时，使用实测S/CO值作图。从理论上说，两个回归方程经统计学检验差异无统计学意义时，可以延续使用上批号质控图。
5.分批质控方法
进行大批量标本的检测时存在批内变异与批间变异的问题。有的实验室每天需测试数百人的血清样品，使用数块甚至数十块微孔板这就存在同一天检测数块板之间的变异(批内变异)和不同天检测之间的变异(批间变异)的问题。推荐进行免疫实验室室内质控的批内、批间室内质量控制具体方法如下(以1 ncu/ml抗-HIV举例)。
5.1 每天进行多个酶标板检测，每板均进行室内质控标本测定，计算室内质控标本的S/CO值，见表1。计算上表各板质控数据均数的均值和标准差时需遵循RCV的计算原则。2o d均值的均数和标准差，即为批间变异的靶值和标准差(
)，以控制天间变异，也称批间变异,以2O天的标准差的均值作为批内标准差，以20天均值的均值作为批内靶值(
)，以控制天内不同检测批之间的变异，也称批内变异。
5.2 批内和批问Levey-Jennings质控图的绘图方法批内Levey-Jennings质控图用每个酶标板质控S/CO值描点，以观察和控制各板之问的变异。批内Levey-Jennings质控图描点最好描在一张质控图上(注意区分，作好相应记录)，便于观察质控结果的集中趋势和离散程度，也可以按完成检测批的先后顺序描在数张质控图上，每天按相应批对应作图。批间Levey-Jennings质控图用发出报告时已经完成的各个酶标板质控S/CO值的均值描点，以控制日间变异。批间Levey-Jennings质控图绘图方法可能有不确定的时候，如完成第一批或第二批时，可能不知道是否还有第三批甚至第四批(对于医院系统尤其可能发生，因为当天标本数量不能确定，而先完成的报告不可能等所有标本完成检测后才发出)，笔者建议可以以当前已有质控S/CO值的均值描点，作为当前批间Levey-Jennings质控图，以判断已完成检测结果的质控状态；当有新的质控数据产生后，与前述质控数据(如有失控，则应剔除失控的质控S/CO值),计算S/CO值均值并描点，作为新的批阅Levey-Jennings质控图，以判断新完成检测结果的质控状态。批间Levey-Jennings质控图描点与批问Levey-Jennings质控图描点一样，既可以集中在一张质控图上作图，也可以按完成检测批的先后顺序分开作图。
以上过程仍可以使用 即刻法”质控方法，批内“即刻法”质控以每天各检测批(第3批起)的质控S/CO值进行,批间“即刻法”质控以每天(第3天起)的质控S/CO值均值进行要特别注意的是，如果在批内和批间Levey-Jennings质控图中使用Westgard多规则，由于每天可能有数个质控点，在选择规则时，不是越多越好，而应重点观察质控结果的集中趋势和离散程度。
6.复检的重要性
实验室应对有疑问的结果进行复检。下面以乙型肝炎标志物为例介绍复检标准及复检结果的判断方法。
6.1 复检标准 复检主要是针对有疑问或少见模式的检测结果进行重新实验。(1)对弱阳性结果进行复检：建议对如下弱阳性结果进行复检：HBsAg 1≤S/CO<10l抗HBs 1≤S/CO<2；HBeAg 1≤S/CO<2；抗-HBe 0.3≤ S/CO<1l抗一HBe 0.3≤S/CO<1。(2)对少见模式结果进行复检：建议对少见模式结果进行复检见表2。
6.2 对复检结果的判断及报告对复查结果的判断应结合比色结果和组合模式进行。初、复检结果一致，报告初检结果；初、复检结果不一致，但均接近CO值，可结合其他指标报告结果，或再次复检，以两次一致结果报告；对体检标本，单独的抗-HBe(或兼抗-HBs)或抗-HBc(或兼抗-HBs)阳性，且接近S/CO值，复检结果为阴性，可报告阴性。已经复检的结果应在报告中加以注明，如“结果已经复查”或“两次结果一致”等。对特殊模式结果提出建议，如“建议重新抽血复查”或“建议跟踪复查”等。
7.质控分析的基本原则
7.1 实事求是的原则 室内质量控制分析的处理方法必须实事求是，充分认识实验过程中可能影响到检验结果可靠性的各种问题，逐一进行分析、纠正。
7.2 不与实验原理和试剂盒使用说明相抵触的原则对质量控制结果的分析和处理必须符合试剂盒的设计原理，并不得与试剂盒使用说明书相抵触，没有根据的分析和处理过程是不被认可的。
7.3 不与临床检验操作规程和质量管理体系相抵触的原则整个分析处理过程务必科学、全面，不与临床检验操作规程和质量管理体系相抵触，要足以为相关举证工作提供依据。
7.4 复检确认的原则几种可能的失控，如假失控，无需立即重新检测患者标本的失控，或者需要立即重新检测患者标本的失控，原则上都必须对质控品进行复检以验证失控原因分析和处理是否正确，以及失控原因是否得以纠正。只有极少数情况，如设置CO公式错误，或选择比色波长不正确，又未超过比色时间，可纠正错误后重新比色，不必复检确认Leve-Jennings质控是最重要的量化室内质控，严谨而客观地实施，动态地分析质控结果十分重要。同时，Levey-Jennings质控有其自身的局限性，它不是判断实验结果是否可靠的唯一标准，实验室每一个环节都与检验质量密切相关，实验室工作人员只有认真对待，耐心细致地做好各方面的工作，才是检验质量可靠性的根本保证。
第二篇：酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）因其方法灵敏、特异、操作简便等优点，自上世纪80年代中期以来，一直是我国医学实验室检测感染性疾病特异抗原、抗体最为常用的方法，并且其今后仍然会是我国基层实验室的主流免疫检测技术。常规ELISA检测操作通常涉及到试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果分析判断及报告等方面，这些关键环节相互关联，任一关键环节的操作不当都会直接影响到测定结果，尤以加样、温育和洗板等步骤为甚，这其中还涉及到实验室质量管理如实验室温湿度控制、仪器设备日常有效的维护等。
在我国的医学实验室，ELISA测定通常为手工操作，由于不同操作者对上述关键环节的把握有差异，因而不同的操作者之间结果有时差异较大，表现为测定的批间变异在不同的操作者及不同的实验室间差异明显，这种差异对于临床强阳性或阴性样本影响不大，但弱阳性样本则极易发生漏检。
自动化检测系统的应用始终是医学实验室所追求的，显然其会避免手工操作带来的重复性和准确性差的问题，自从上世纪90年中后期以来，全自动加样系统和全自动酶免分析系统在医学实验室得到了推广应用，尤以采供血机构实验室最为普遍。但在实际应用中，仍然存在超时温育、洗液污染、仪器设备维护不到位、编程不合理等而导致检测结果失准的问题。
医学实验室管理经历了经验管理、质量检验管理、统计质量管理、全面质量管理等阶段，全面质量管理以ISO15189标准为标志，但现在已经发展到“标准化+全面质量管理”的时代，因为仅有质量管理，没有标准化仍然难以避免检验结果在准确性和重复性上存在的问题，也难以实现卫生部要求的实验室之间结果互认的要求。
医学实验室常规检验的标准化不仅是一个测定系统或试剂的量值溯源，其还涉及到临床标本的采集运送和保存、检测系统或试剂的性能验证、检测程序、仪器设备的维护和校准、结果的分析报告和解释等的标准化，对ELISA这种“价廉物美”的测定在医学实验室的应用，在借助必要的自动化分析仪器设备的基础上，进行标准化，将极大地提高其对临床疾病诊疗的有效性，并大大降低患者的医疗费用，为建设和谐社会贡献力量。