讨论报告：

酶联免疫吸附试验（ELISA）

                   

一．简介

1.定义：指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

2.基本原理：（1）抗原或抗体的固相化（2）抗原或抗体的酶标记（3）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

大致流程：

3.测定类型

 3.1酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置

  

这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。

 3.2 ELISA实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质：

3.2.1 可逆性

3.2.2 特异性  抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

3.2.3 存在最适比例 

 

    3.2.4 敏感性高  由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

 3.3 ELISA的主要测定方法

        ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，各种那个测定方法中均有三个必要试剂：

       （1）故乡的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（2）酶标记的抗原或抗体，称“结合物”（3）酶反应的底物

  3.3.1双抗体夹心法

    3.3.1.1双抗体夹心法测抗原

 

    3.3.1.2双抗体夹心法测抗体

 

  3.3.2 间接法测抗体   

 

  3.3.3 竞争法

    3.3.3.1竞争法测抗体

 

   

    

        3.3.3.2竞争法测抗原

 

4.试剂准备

     现市面上易得各大生物技术公司生产的ELISA试剂盒。所以按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

5.对照设定

 

6.标本的采取和保存

7.基本操作注意事项

     （1）加样：在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

（2）保温：抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。

           ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？

           温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。

   保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

（3）洗涤：洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。

           ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。

           洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：

A.流水冲洗式  流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。

B.浸泡式  微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

(4)显色：显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。

        TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

（5）比色：拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。

 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

           结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

   使用酶标比色仪比色时，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。

8.结果判定

     8.1定性测定

定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

          在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同。

   8.2 定量测定

           ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

           测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。

   9.ELISA的操作要点

        严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。

        严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。

   10.临床应用  

        由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。

二．讨论

问题：怎样才能使ELISA试验所得结果准确性提高？通过哪些可控制因素可以做到？

ELISA试验涉及步骤多，影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，可能出现错误的结果。但如果我们控制了这些因素，就可以把其不良影响降到最低。可以从以下几方面着手

1.试剂因素

（1）试剂的选择：试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。现ELISA试剂均由生物技术公司出售，但不同厂家的试剂在使用效果上存在差异。所以要选购知名度相对高的品牌，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。

（2）试剂的准备：ELISA反应涉及酶促反应，需要有适宜的温度。因此临床试验时，将试剂从冰箱中拿出来即用的做法有可能导致对一些弱阳性标本的检测出现假阴性的后果。所以在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min 后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。

2.样本因素

 （1）内源性干扰因素

    临床ELISA试验的样本多是直接采集患者血清，因此血清中包含多种杂质，其中目前我们大二学到的物质有补体。

补体：在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc 段的补体C1q 结合点暴露出来， 使C1q 成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。解决的办法是：①用EDTA 稀释标本。②56℃ 30min 加热血清使C1q灭活。

  （2）外源性干扰因素

包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

A.标本的溶血：血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA 测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP 底物反应显色。所以在采血时应注意手法，采集的血液勿用力振荡，严防标本溶血。

B.标本的污染：污染物菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。因此，ELISA 检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d 之内应4℃保存，1 周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。

C.标本的保存：标本在冰箱中保存过久，血清中IgG 可聚合成多聚体，AFP 可形成二聚体， 在用间接法测定中会导致本底过深， 甚至造成假阳性。冰冻保存的标本反复冻融产

生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用，可引起假阴性结果。因此，ELISA 检测尽量采用新鲜标本，长时冻存的样本避免反复融冻。

D.标本凝固不全：凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。解决的方法有：①于采血管中加入适当的抗凝剂；②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h，待充分凝固后再离心分离血清。

3.操作中的因素

      加样、保温等因素在“一.简介”的“7.基本操作注意事项”中已提到。除上述几点外，还应注意以下内容：

“边缘效应”的排除：“边缘效应”是在使用96 孔板的ELISA 测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96 孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。

4.结果判定

  读取结果要在15～30 min 内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10~15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果， 酶标仪不应置于阳光或强光照射

下，需先预热15～30 min 再进行测试。

第二篇：CX3CL1试剂盒,人神经趋化蛋白(fractalkineCX3CL1)酶联检测分析ELISA使用说明书

CX3CL1试剂盒,人神经趋化蛋白（fractalkine/CX3CL1）酶联检测分析ELISA使用说明书

本试剂仅供研究使用      标本：血清或血浆

樊克生物专业供应：

使用目的：

本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本神经趋化蛋白（fractalkine/CX3CL1）含量。

试验原理：

fractalkine/CX3CL1试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知fractalkine/CX3CL1浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将fractalkine/CX3CL1和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中fractalkine/CX3CL1的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制

自备材料

1．  蒸馏水。

2．  加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．  振荡器及磁力搅拌器等。

安全性

1．  避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．  实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3．  不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项

1．  试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2．  实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3．  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4．  使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5．  使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6．  洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7．  底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8．  加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9．  按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法

1、  血清－－－－-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、  血浆－－－－-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、  细胞上清液－－-1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、  组织匀浆－－－－-将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5、  保存－－－－－－如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备

1．  标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：

2．  洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

操作步骤

1．  使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．  根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3．  加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4．  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．  每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．  每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8．  取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．  在450nm波长处测定各孔的OD值。

建议使用的实验方案

局限

6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

神经趋化蛋白（fractalkine/CX3CL1）ELISA试剂盒性能

1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

结果 判 断 与分析

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的fractalkine/CX3CL1标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的fractalkine/CX3CL1含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

3、检测值范围：0-80ng/ml

4、敏感度： 0.1 ng/ml

上海樊克专业生产供应的试剂盒类产品有：双抗夹心ELISA检测、ELISA试剂盒、人ELISA试剂盒、酶联检测试剂盒、国产进口试剂、代测elisa试剂盒、ELISA检测试剂盒、大鼠ELISA试剂盒、小鼠ELISA试剂盒、凋亡相关因子试剂盒、白介素ELISA试剂盒、VIP ELISA kit等实验室产品，产品品质，质量保证。

The performance of kit:

1 sensitivity: minimum detection concentration is less than 1 standard. Linearity of dilution. Sample linear regression and the expected concentration correlation coefficient R value is 0.990.

2: no specific reaction with other cytokines.

3 repeatability: plate, plate between the coefficients of variation were less than 10%.

Human type III procollagen amino terminal peptide ELISA kit steps:

1 before use, all reagents and mixing. Do not allow liquid to produce a large number of bubbles, so as to avoid adding a large number of bubbles, resulting in the addition of the error.

2 according to determine the number of sample number plus standard strip number. Each standard and blank hole is recommended to do the hole. Each sample can be made according to its own quantity, and can be used as a hole in the hole.

3 diluted after standard 50ul in reaction hole, added to the sample 50 UL in reaction hole to be measured. Immediately joined the 50 UL antibody biotin. Cover the membrane plate, gently oscillating mixing, 37 degrees Celsius for 45 minutes.

4 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.

5 per hole adding chain affinity enzyme -HRP 100ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 30 minutes incubation.

6 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machine with washing, washing times increased once.

7 per hole adding substrate A, B 50ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 5 minutes incubation. Avoid light.

8 remove ELISA plate, quickly add 50ul terminated liquid, adding the stop solution immediately after the determination results.

9 od determination of each hole at the wavelength of 450nm.

The result of judgment and analysis:

1, instrument value: Yu Bo 450nm ELISA od read the hole on the instrument

2, to the OD value as a vertical coordinate (y), corresponding ot standard concentrations as a horizontal coordinate (x), do have corresponding curve, sample ot content can be according to the OD value by standard curve conversion out corresponding concentration, multiplied by the dilution multiple; or with the standard concentration and the OD value calculated the regression equation of the standard curve, the sample OD value in the equation to calculate the sample concentration, multiplied by the dilution factor is the actual concentration of the sample.

3, detection range: 0-100ng/ml

4, sensitivity: 0.39ng/ml