免疫组化染色实验操作流程
实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组
标本：经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4?m厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法
2.1 实验试剂：
xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
2.2 仪器
(1)10?l、100?l、200?l、1000?l可调微量加样枪
（2）4℃冰箱
(3)光学显微镜
(4)恒温水浴锅
(5)恒温烤箱
(6)电热蒸馏水器
(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统
(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
2.3 主要试剂的配置
（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液
NaCl 磷酸氢二钠
磷酸二氢钠
（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）
A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)
B液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)
缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）
（3）3%H2O2
30%H2O2：甲醇=1：9
(4)0.1%Triton的配制
Triton原液 0.1 ml
0.01PBS液 99.9ml 29.01g柠檬酸 29.41g柠檬酸钠 A液（18ml）+B液(82ml) 1000ml ddH2O 1000ml ddH2O 900ml dH2O 9.0 g 2.901 g 0.296 g 加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。充分混合 充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0
4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）
羊血清 50?l
0.1%Triton 950?l
4℃保存。
2.4免疫组化方法
(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.
(2)石蜡切片常规脱蜡
二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min --无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ 5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min --蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。
（3）抗原修复：切片浸入沸腾的盛0.01M柠檬酸缓冲溶液（PH 6.0）的压力锅内盖上锅盖，加上压力阀，继续加热至喷气，开始计时2min后，离开热源自来水冲洗至室温。取出切片，蒸馏水冲洗2次，每次3min。
（4）0.01MPBS液冲洗5min，2次
(5)甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50?l）3%H2O2室温孵育10min(目的：阻断内源性过氧化物酶活性)
(6)PBS冲洗5min，3次
(7)甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50?l）羊血清室温孵育10min。
(8)甩去血清。
a:每张切片滴加1滴X抗体（50?l），4℃过夜（约18h）
b: 每张切片滴加1滴X抗体（50?l），室温过夜（约20℃）
(根据不同抗体选择不同温度、时间过夜)
(9)室温下孵育 45min，PBS液漂洗5min，3次
(10) 甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50?l）聚合物增强剂（A剂），室温下孵育20min
(11) PBS冲洗5min，3次
(12) 甩去PBS液，每张切片滴加1滴（50?l）聚合物增强剂（B剂），室温下孵育30min
(13)PBS液漂洗5min，3次
（14）甩去PBS液，每张片滴加2滴新配置的DAB溶液，显微镜下3-10min，观察显色情况
(15)自来水冲洗
(16)梯度酒精脱水：70%-80%-90%-100%Ι-100%Ⅱ，每次10min
(17)脱色：二甲苯Ι-二甲苯Ⅱ，每次30min
(18)中性树脂胶封固。（怎么封？）
（19）显微镜下观察结果并照相。
第二篇：免疫组化实验操作
1 仪器设备
（1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
（2）水浴锅
2 试剂
（1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
（2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
（3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
（4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
（5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
（6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
（7）封裱剂：
a 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b 油和TBS（或PBS）配制。
（8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 3 操作流程
（1）脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
（2）抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
2）煮沸热修复
电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
3）微波热修复
在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
4）酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
（3）免疫组织化学染色 免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ：
（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化实验结果的判定和分析
从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，需要实验数据否，图片的数量与规格等。如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。
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免疫组化在临床工作的意义
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.
染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
(1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；
(2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
(3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
（4）软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；
（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。
（6）为临床提供治疗方案的选择。