BSL-2/ABSL-2生物安全实验室/病毒实验室
基本要求BSL-2实验室培训
?申请人具备3个月以上的细胞室工作经验；能够严格遵守本单位及实验室生物安全规程；既往无不良安全行为记录。
特别要求BSL-2+实验室培训
除满足基本要求外，还应具备以下条件：申请人参加过BSL-2实验室培训，并具备3个月以上BSL-2实验室工作经验。
特别要求ABSL-2实验室培训
除满足BSL-2+实验培训要求外，还应具备以下条件：已取得上海市实验动物上岗证；或参加过上海巴斯德研究所实验动物上岗培训并考试合格
生物安全
?狭义指现代生物技术的研究、开发、应用以及转基因生物的跨国越境转移可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的不利影响。广义指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康及生态系统所产生的危害或潜在风险。
实验室生物安全
1防止发生病原体或毒素无意中暴露或意外释放的防护原则、技术和行为。
2实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区和环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。
生物安全
?防止发生病原体或毒素无意中暴露或意外释放的防护原则、技术和行为。
生物安全保障
?单位和个人为防止病原体或毒素丢失、被窃、滥用、转移或有意释放而采取的安全措施。
实验室相关感染
实验室感染主要途径
?注射器针头或其他污染锐器意外接种；液体溢洒和喷溅到皮肤和粘膜；通过口吸移液或用手指或污染的物体触摸口或眼睛从而摄入或接触；动物咬伤和抓伤；吸入传染性气溶胶；
?20%可明确感染的原因；80%是由工作人员操作失误引起；20%是由设备故障引起；80%是不明原因的感染，可能为气溶胶传播感染。
实施实验室生物安全管理的目的
保护人员和环境免受感染性生物因子的潜在暴露
实验室生物安全管理体系目标
?保证实验室设施、设备、个体防护装备及相关物品符合国家有关的安全要求，定期检查、维护、更新，确保不降低其设计性能。保证实验工作人员均可得到持续培训及继续教育。提供必要的免疫计划、定期健康检查和医疗保障。
管理体系文件
管理手册，程序文件，标准操作规程、安全手册，记录、标识
实验室生物安全管理员职责
针对技术方法、程序和方案、生物因子、材料和设备进行定期的内部安全检查；纠正违反生物安全操作规程的行为；在发生感染性物质泄露或其他事故时，协助事故处置和调查；检查和监督实验室废弃物的有效管理与安全处置；检查和监督实验室各项消毒灭菌措施的落实情况。
实验室工作人员
充分认识和理解所从事工作的风险；自觉遵守实验室的管理规定和要求；在身体状态许可的情况下，应接受实验室的免疫计划和其他的健康管理规定；按规定正确使用设施、设备和个体防护装备；主动报告可能不适于从事特定任务的个人状态；不应因人事、经济等任何压力而违反管理规定；有责任和义务避免因个人原因造成生物安全事件或事故；如果怀疑个人受到感染，应立即报告；主动识别任何危险和不符合规定的工作，并立即报告。
风险评估与控制
危险 可能导致死亡、伤害或疾病、财产损失、工作环境破坏或这些情况组合的根源或状态。
风险 危险发生的概率及其后果严重性的综合。
风险评估 评估风险大小及确定是否可接受的全过程。
风险控制 为降低风险而采取的综合措施。
危险度分级Risk Group
Risk Group Individual Risk Community Risk
I No or Low No or Low
II Moderate Low
III High Low
IV High High
病原微生物分类与防护水平
第一类 能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。Smallpox
第二类 能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。HIV
第三类 能够引起人类或动物疾病，一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并具备有效治疗和预防措施的微生物。HBV
第四类 在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。Mouse Leukemia Virus
病毒培养：指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组试验等操作。利用活病毒或其感染细胞（或细胞提取物），不经灭活进行的生化分析、血清学检测、免疫学检测等操作视同病毒培养。（如大量活菌操作）
动物感染实验：指以活病毒感染动物的实验。
动物感染实验未经培养的感染性材料的操作：指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析等操作。未经可靠灭活或固定的人和动物组织标本因含病毒量较高，其操作的防护级别应比照病毒培养。（样本检测）
灭活材料的操作：指感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析、分子生物学实验等不含致病性活病毒的操作。
无感染性材料的操作：指针对确认无感染性的材料的各种操作，包括但不限于无感染性的病毒DNA或cDNA操作。（非感染性材料的实验）
生物安全屏障
一级屏障 即生物安全设备，包括：个体防护装备、生物安全柜、动物隔离箱、安全离心杯
二级屏障 即实验室设施设计和结构，包括：围护结构、通风空调系统、供水供气系统、电力供应系统、照明系统、监控报警系统、消毒灭菌系统
生物安全防护（三要素实验室操作技术、安全设备（一级屏障）、设施设计和结构（二级屏障））
一级防护 通过良好的实验室操作技术，合适的生物安全设备来防止工作人员或者实验室环境对生物因子暴露
二级防护 防止实验室外部环境对生物因子暴露
Bio-safety level(BSL) 表示仅从事体外操作的实验室的相应生物安全防护水平。
Animal bio-safety level (ABSL) 表示包括从事动物活体操作的实验室的相应生物安全防护水平。
BSL-1实验室基本防护要求
?在靠近实验室出口处设置洗手装置；在实验室出口处应设存衣或挂衣装置，个人服装与工作服分开放置；人员工作时应穿工作服，戴手套；
BSL-2实验室基本防护要求
?符合BSL-1实验室的要求；实验室进入控制措施；在实验室或其所在建筑内配备高压灭菌设备；病原微生物应在生物安全柜内操作；工作区应配备紧急洗眼装置；人员工作时应穿工作服，戴手套、口罩和帽子，以防气溶胶污染；
1进入控制
实验室门口应张贴国际通用的生物危害标识
?仅授权人员可以进入实验室
?禁止儿童进入实验室
?实验室门应保持锁闭
?应标明实验室操作的微生物
人员培训与考核
?人员健康管理
? ?出入记录
2操作规范
l 洗手 接触感染性物质后和离开实验室工作区域前
l 禁止在实验室工作区域内从事下列行为（进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、使用化妆品、储存食品）
l 移液（禁止口吸移液，必须使用机械移液装置）
l 锐器处置?禁止将锐器随意弃置于塑料，必须使用专用锐器收集容器
l 废物包装袋?
l 控制溅出和气溶胶产生
l 去除工作台面污染或感染性物质溅出后 使用适当消毒剂
3工作完成之后
废弃物处置?分类收集，固体液体分开；收集于防漏包装袋和容器；使用有生物危害的红色或黄色可高压蒸汽灭菌包装袋；废弃物应高压灭菌；
4工作过程中
必须穿着实验室防护服以防污染个人衣物；工作时必须戴手套以保护双手暴露于危险性材料；当手套被污染、破损或必要时应更换手套；每当操作危险性材料的工作结束时离开实验间前，除去手套并洗手；不要清洗或重复使用一次性手套；如果有可能发生微生物或其他有害物质溅出，要佩戴防护眼镜；涉及感染性物质的所有操作均应在生物安全柜或其它防护装置内进行。
离心 1使用密封转头或安全离心杯?2一定要在生物安全柜内打开
BSL-2实验设施及操作规程
实验室分区
1实验室防护（工作）区
实验室的物理分区，该区域内生物风险相对较大，需对实验室的平面设计、围护结构的密闭性、气流，以及人员进入、个体防护等进行控制的区域。
2核心工作间（主实验室）
防护区中直接从事高风险操作的工作间。
3辅助工作区
生物风险相对较小的区域，也指实验室中防护区以外的区
消毒灭菌设备（灭菌锅、紫外灯、过氧化氢发生装置）
常用消毒剂 2%戊二醛、75%乙醇、二氧化氯、含氯消毒剂（三氯异氰尿酸等）
个体防护装备
?防护服、手套（双层）、口罩、防护帽、防护镜、鞋套、防水围裙套袖。
l 在辅助工作区无需使用PPE。
l 进入防护区时应使用第一层PPE，包括：一次性鞋套、工作服、第一层乳胶手套、帽子、口罩。在半污染区中操作超速离心机和-80℃冰箱必须戴第二层乳胶手套。
l 在核心工作间开展病原微生物实验活动时应增加第二层PPE。包括：第二层乳胶手套、一次性围裙套袖或反穿衣、防护镜。
PPE脱除程序
?第二层PPE应在离开核心工作间时脱下。第二层手套应先消毒再脱下。第一层PPE应在离开防护区时脱下。离开实验室时应使用流水和洗手液洗手。
运输包装要求
l 在实验室内和本单位内运输感染性物质标本时必须遵守双层防护原则，使用两层包装系统。装载感染性物质标本的内层容器必须放到一个外层容器中，并保持内层容器固定直立。外层容器应防破裂、防泄漏，并可耐受高压灭菌和化学消毒剂作用。
l 对外运输包装要求 对外运输感染性物质过程中应使用三层包装系统，包括内层容器，第二层包装容器及外层包装材料。装载标本的内层容器必须防水、防漏并贴上指示内容物的适当标签。内层容器外面要包裹足量的吸收性材料，以便内层容器打破或泄漏时能吸收溢出的所有液体。
保存与使用
?感染性物质应贮存于指定的冰箱，冰箱门应张贴生物危险标识。
?感染性物质的监管实行双人负责制，由实验室负责人和其指定的责任人共同管理。保藏冰柜实行双锁管理。每次存取感染性物质必须登记。
?感染性物质的所有操作必须在Ⅱ级生物安全柜中进行。开放式的工作台上不允许操作这类物质。
?所有涉及感染性物质的使用过程都应如实记录，包括领取和使用的时间，感染性物质名称及数量。不经实验室负责人批准，不得将感染性物质带出实验室。
?实验工作结束后，未用尽的感染性物质和使用后得到的产物应按要求进行处理、销毁或保存，并如实填写实验记录。
实验室内空气的消毒和灭菌
?实验室房间、生物安全柜、传递窗内的悬吊式紫外消毒灯等对上述空间内的空气进行消毒，安装数量为平均1.5W/m3，照射时间30-60分钟。
?甲醛熏蒸可对实验室空气、设备以及物体表面的微生物实现有效灭菌。
?二氧化氯喷雾可对实验室空气、设备以及物体表面的微物实现有效消毒灭菌。
物体表面消毒灭菌
?实验室地面应湿式拖扫，禁止干拖干扫和使用吸尘器。可使用含氯消毒液（有效氯含量1000-2000mg/L）喷洒后拖扫。拖把应专用，污染区和清洁区不得混用。应使用可装配吸水布或纸巾的拖把，使用后用应将吸水布或纸巾作为感染性废物处理。
?实验台面、桌子、椅子、凳子、门把手、实验记录夹等可用75%乙醇喷洒擦拭，消毒作用不少于20min。
?实验材料的表面可用75%乙醇擦拭或喷洒消毒。
仪器设备的消毒灭菌
显微镜、离心机、冰箱、培养箱、移液器等局部轻度污染时，可用先后用2%戊二醛和75%乙醇擦拭。污染严重或传染性强的，半小时后重复擦拭一次。如需整体灭菌，应使用甲醛熏蒸或二氧化氯喷雾。
手的清洁消毒
?离开BSL-2实验室污染区，脱防护服前应75%乙醇洗手消毒。
?实验室工作完毕后应立即进行手部清洗和消毒。采用非自动洗手设备，水龙头开关尽量应用长柄式、脚踏式或感应式。使用瓶装式液体皂，洗手后用一次性纸巾或烘干机烘干。在无流动水情况下，可使用含乙醇免洗消毒洗手液。
废弃物处置程序
分类收集
?实验室废物应根据其特性分别按照感染性废物、病理性废物、
损伤性废物(锐器)、化学性废物进行分类收集。危险废物应使用专用容器收集。在设有分区的实验室中，不同区域的废物应分开收集。实验废物应收集于所在区域的废弃收集容器内。感染性实验废物应使用专用黄色包装袋收集，包装袋应置于专用硬质收集箱桶里。
?BSL-2实验室防护区中产生的实验废物均应视为感染性废物。
核心工作间中可使用红色高压灭菌袋收集。生物安全柜中产生的废物应在生物安全柜内消毒、收集、包装后移出。损伤性废物（锐器）应使用有盖、耐刺破的黄色利器盒收集，并按感染性材料处置。感染性液态废物应收集于实验室内的可密闭收集桶中，禁止直接向下水管道中排放。收集容器内实验废物超过容量3/4时必须进行清理。实验废物应每天至少清运一次。
消毒灭菌
?感染性废物的消毒灭菌方式包括：化学消毒、高压灭菌、高温焚烧。
?感染性废物收集前应先进行化学消毒。
?BSL-2实验室感染性废物送出实验室前应高压灭菌。如实验室不具备高压灭菌条件，可送至清洁室高压灭菌。实验废物送出BSL-2实验室前应消毒包装袋外表面。
任何需重复使用的感染性材料必须在消毒灭菌后进行清洗、修复。
?BSL-2实验室使用过的防护服、毛巾应高压灭菌后再送出洗涤。
?BSL-2实验室产生的含有感染性物质的液态废物应使用消毒剂处理后集中收集于密闭容器。移出实验室前应使用含氯消毒剂处理。处理时间应不少于2小时，有效氯含量应大于2000mg/L，处理过程中容器应保持密封。BSL-2实验室废液移出实验室前应对容器外表面进行化学消毒
离心准备工作要求
?检查转头或离心杯密封圈
?离心管内液体不应过量
?密闭离心管
?离心管放入转头或离心杯前应去除表面污染
?密闭转头或离心杯
?去除转头或离心杯表面污染
?使用纯水或酒精作为配平液体
?应在用于配平的离心管盖上作标记
离心结束后的工作要求
?在生物安全柜内打开转头或离心杯
?从生物安全柜内取出转头或离心杯时应去除污染
生物安全柜
操作规程
个人防护要求（在使用生物安全柜时必须穿个人防护服，戴手
套；应戴口罩和帽子，根据需要带防护眼罩或者面罩。）
柜内物品的摆放按照从洁净区到污染区的方向摆放。所有物品尽可能放在工作台后部。将废物袋、移液管收集盘、吸滤瓶等大体积物品放在柜内一侧。
前后格栅不能被纸、仪器设备或者其他物品阻挡。
紫外消毒灯 每周清洁，除去可能影响杀菌效果的灰尘和污垢。房间中有人时一定要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害。
避免明火 火焰可造成生物安全柜的气流紊乱，干扰气流模式。可损坏HEPA过滤器。处理挥发性物品和易燃物品时易造成危险。
工作前准备
打开安全柜的日光灯和风机；安全柜运行15min，净化工作区的空气污染物；用适当消毒剂擦拭生物安全柜的工作台面及内壁以去除污染；将实验中需使用的物品集中用消毒剂擦拭后放在台面相应位置上。
工作中操作
避免手臂在前开口处快速移动和频繁进出。尽量避免污染的物品进入洁净区。在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。尽量减少操作者身后的人员活动。操作者的面部应始终在移动档板后面。
溢出处理
始终保持生物安全柜运转状态，不要关闭风机。在溢出物上覆盖浸有消毒剂的吸水材料，保持适当时间以
发挥消毒作用。在安全柜内消毒污染的手套。如果防护服已被污染，也应消毒。更换新的手套和衣服后进行下一步的清洁工作。所有废弃物以及防护服进行高压灭菌。清洗手部和其它部位暴露皮肤。立即通知实验室相关管理人员。如果溢出物流入安全柜内，可能需要对安全柜进行彻底消毒。
工作结束后处理
保持安全柜继续运行至少5min完成净化。将柜内物品移出前，应使用适当消毒剂擦拭去除表面污染。工作结束后应使用适当消毒剂擦拭生物安全柜的内壁和台面，以去除污染。关闭前窗，关日光灯，关风机，开紫外消毒灯照射至少30分钟。
实验动物微生物和寄生虫控制分级
一、分级：
1、普通级动物（CV）
概念：普通级动物是指饲养在开放系统中，在微生物控制上要求最低的动物，它要求不携带人畜共患病和动物烈性传染病的病原。
特点：①来源于清洁动物或SPF动物，在开放系统中饲养。饲养成本低，价格便宜，可大量供应。②微生物控制程度低，但应排除人畜共患病和动物烈性传染病。③对实验反应性差。
2、清洁动物(CL)
概念：除不带有普通级动物应排除的病原外，还不应携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。
特点：①来源于SPF动物或无菌动物，在屏障系统中饲养。②较普通级动物健康，又比SPF动物容易达到质量标准。③对实验干扰较少，实验重复性和敏感性较好，是我国主要的科研用动物。
3、无特定病原体动物(SPF)
概念：无特定病原体动物是指动物体内无特定的微生物和寄生虫存在，但带有非特定的微生物和寄生虫的动物。
特点：①来源于无菌动物或悉生动物，饲养在屏障系统中。②属健康无病动物。繁殖率高，自然死亡率低。③不干扰科研实验，实验结果可靠，是国际上公认的科研用动物。
4、无菌动物(GF) 包括悉生动物(GN)
概念：无菌动物是指用现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何活的微生物和寄生虫的动物。
特点：①来源于剖腹产或无菌卵的孵化，饲养在隔离系统中。②体内外无菌，饲养较困难。③形态学和生理学在某些方面与常规动物不同。
5、悉生动物(GN)
概念：悉生动物是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物。植入一种细菌的动物叫单菌动物；植入两种细菌的动物叫双菌动物；植入三种细菌的动物叫三菌动物；植入多种细菌的动物叫多菌动物
特点：①来源于无菌动物，对动物所带的微生物明确。饲养在隔离系统中。②与无菌动物相比，生活力、抵抗力较强，容易饲养。③在某些实验中，可代替无菌动物。
实验动物常见疾病
鼠痘（脱脚病）、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、小鼠肝炎、仙台病毒、沙门氏菌感染、霉形体感染、螨病
动物实验中的生物危害
生物危害是指在科学实验中，由于实验人员的错误操作，而使有害病原体散播到外界，污染外界环境，并造成周围人及动物感染发病。
第一类：天花病毒
第二类：鼠疫耶尔森菌，霍乱弧菌，布鲁氏菌属，炭疽芽胞杆菌，乙型脑炎病毒
第三类：金黄色葡萄球菌，链球菌属，仙台病毒（鼠副流感病毒1 型）
第四类：小鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒
小鼠标记
( 1) 3- 5％苦味酸溶液，可染成黄色。——作为“个”位数。
( 2) 0.5%中性红或品红溶液，可染成红色。——作为“十”位数。