实验五霉菌的形态观察、微生物的测微与计数

一．实验目的

1.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，初步了解霉菌的形态特征及鉴别依据。

2.学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。

3.了解血球计数板的构造和使用方法。学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。

4.总结并掌握细菌、放线菌和霉菌的鉴别方法。

二、实验原理
1. 霉菌定义及用途

n  霉菌不是真菌分类中的名词，而是丝状真菌的统称。

n  霉菌在自然界中广泛分布，与食品的关系密切，是人类在实践活动中最早利用的一种微生物，如早期进行的酱和酱油的制作等。

n  霉菌也可以使食品发生腐败变质或产生毒素，影响人体健康甚至危及生命。

2.霉菌特征

n  霉菌可产生分支的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

n  菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

n  霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约3-10um)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。因此，用低倍镜即可观察。

3.霉菌的菌落

n 松：由于霉菌的菌丝较粗较长，菌丝体疏松，因而形成的菌落也比较疏松，呈绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状；

n 大：菌落形态较大，一般比细菌和放线菌的菌落大几倍到几十倍，有时会长满整个培养皿；

n 干：外观干燥，不透明；

n 挑：菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取；

n 颜色：由于基内菌丝、气生菌丝、孢子颜色不同，不同的霉菌菌落表面呈现不同的颜色，菌落正反面、边缘与中心颜色常不一致。

   

同一种霉菌在不同的培养基上或不同的培养条件下所形成的菌落特征可能有所不同。但同一种霉菌在相同的培养条件下和培养基上所形成的菌落特征相对稳定。菌落特征是霉菌鉴定的重要依据之一。

4、霉菌的菌丝形态

n  构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝的宽度一般为3-10μm，比放线菌菌丝宽很多倍，其菌可伸长并产生分枝。

  许多分枝的菌丝相互交织在一起，称为菌丝体。

n  一部分菌丝存在于培养基质中吸收营养，称为基内菌线或营养菌丝。

n  另一部分菌丝向空中生长，称为气生菌丝。气生菌丝一部分形成生殖细胞，也有部分气生菌丝生成生殖细胞的保护组织或其它组织。

4、霉菌的菌丝

从结构来看，霉菌的菌丝有两种：

无隔菌丝：低等霉菌如根霉、毛霉等

有隔菌丝：高等霉菌如青霉、曲霉等

菌丝的孢子较大，在低倍镜下即可清晰观察到有隔或无隔菌丝和孢子及巨大的孢子囊。

5、霉菌的繁殖方式和繁殖结构

n  霉菌主要靠形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖。

n  霉菌的无性孢子：

厚垣孢子

节孢子

分生孢子

孢囊孢子

6、食品中常见的霉菌

霉菌的种类很多，下面仅介绍一些常见的、与食品有关的菌属。

（1）根霉菌属（Rhizopus）

现已发现根霉有20多种，根霉有假根和葡匐枝，假根主要起固定和吸收营养的作用。本属的黑根霉能产生果酸酶，引起果实的腐烂及甘薯的软腐，能产生反丁稀二酸，也是转化甾族化合物的重要霉菌。

（2）曲霉菌属（Aspergillus）

n      现已发现和应用的曲霉菌有100多种，在我国古代已利用曲霉菌制曲、酿酒、制酱等。曲霉菌还可用于制造蛋白酶、柠檬酸等一些有机酸。曲霉菌在自然界分布很广，空气中经常含有曲霉菌的孢子。常引起食品、衣服、皮革等物品的发霉和腐烂，有的菌株还可产生毒素，例如黄曲霉。

n      曲霉菌具有发达的菌丝体，菌丝有隔膜，为多细胞菌丝。繁殖方式为无性和有性繁殖。其菌落呈现各种颜色。

（3）青霉菌属（Penicillium）

n      青霉菌在自然界的分布也非常广泛，土壤中常常有大量的青霉菌存在，在水果和粮食上经常发现青霉菌，已发现大约有几百种。青霉菌的菌丝体无色或浅色。菌落是深绿色。

n      青霉菌可引起果蔬等的病害，如引起柑桔的病害而造成较大损失。但有些青霉菌能产生有经济价值的有机酸，如柠檬酸，葡萄糖酸等。在医药上常用的青霉素的产生菌是产黄青霉。

三、实验内容

（一）实验材料

1、菌种：培养法培养3~4天的根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillum sp.）和曲霉（Aspergillussp.）平板。

2、其他物品：乳酸石炭酸溶液、载片、盖片等。

（二） 记录三种霉菌的菌落特征

2、霉菌个体形态观察

n  直接制片观察：于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸液于载片中央；

n  用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液滴中，再细心地将菌丝挑散开；

n  然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。

n  置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。

n  挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态。

n  加盖玻片时切勿压入气泡，以免影响观察。

（1）水浸片法观察（根霉与曲霉）

根霉：加热至沸腾后观察

曲霉：直接观察

第二节   微生物大小的测定

一、实验原理

n      微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

n      镜台测微尺适用于校正目镜测微尺每个的相对长度。然后，根据微生物细胞相当于目镜测微尺的个数，即可计算出细胞的实际大小。

实验程序Ⅰ（测定微生物的大小）

n  测定的工具：目镜测微尺    镜台测微尺

实验程序Ⅱ  （测定微生物的大小）

目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10µm，所以可得：

  目镜测微尺每格长度（ µm）=（镜台测微尺格数×10）/目镜测微尺格数

n  注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。

n  菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。

操作步骤

1、装目镜测微尺

2、校正目镜测微尺

3、菌丝体大小测定：将观察的黄曲霉菌丝体直接进行菌丝体大小的测定

4、测定完毕后，取出目镜测微尺用擦净纸擦干净，放回盒内保存。

第三节 微生物的显微计数

?          血球计数板通常是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。

?      中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。

每个方格网共分九大格，其中间的一大格又称为计数室，微生物的计数就在此大格中进行。

?          常用的血球计数板的计数室有两种规格的刻度网格。

?          一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，即为16×25。

?          另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，即25×16。

?          但是不管计数室是那种规格，其计数室的小格数总是相同的，即16×25＝25×l6＝400（小格）

计算

　　每一个大方格边长为1mm，则每一大方格面积为1mm2。盖上盖玻片后，载玻片计数室与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。

　　在计数时，通常数五个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的总菌数。然后再换算成1毫升菌液中的总菌数。
（1ml＝1cm3＝1,000mm3）

实验材料

?          酵母菌悬液

?          显微镜，血球计数板。

盖玻片，无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，香柏油、镜头洗液。

1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。
2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。
3. 用10×镜观察并将计数室移至视野中央。
4.  在10×镜下计数：计数4个（或5个）中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出计数区总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。
5. 注意事项：计上不计下，计左不计右。出芽计一半

实验程序

计数步骤：

1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。

2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。

3. 静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数板的大方格网位置。寻找时光圈要缩小，光线要偏暗些，并将计数室移至视野中央。

4. 在高倍镜下计数：随机地计数五个中格内的菌数，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每毫升菌液中的含菌数量。

由于菌体细胞在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，故观察时必须不断调节微调节器，方能数到全部菌体，以免遗漏。

5. 计算方法：
酵母菌细胞数／毫升=[（X1+X2+X3+X4+X5）/5]*25（或16）×10×1000×稀释倍数

6. 注意事项。
计数时，为避免重复或遗漏计数，凡是遇到压在方格线上的菌体，一般以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内，遇到有芽体的酵母时，如果芽体和母体同等大时，就按两个酵母菌体计数。

7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净并放回盒。

将显微计数结果记录于下表中。T表示五个中方格中的总菌数；D表示菌液稀释倍数。

第四节 四大类微生物的比较与分别

1、四大类微生物菌落形态特征的比较

2、制片和观察方法的区别

n  细菌干燥、固定后美蓝染色、革兰氏染色，用油镱（100×10）进行观察；

n  酵母美蓝水浸片染色，用高倍镜（40×10）观察；

n  放线菌美蓝盖片染色，菌丝体和孢子一般用高倍镜（40×10）观察；

n  霉菌：乳酸石碳酸棉蓝染色，菌丝体和孢子一般用高倍镜（40×10）观察。

3、个体形态与大小区别

n  细菌：呈球状、杆状、螺旋状，个体微小，小于1微米。

n  放线菌呈分枝丝状，菌丝无隔膜，单细胞，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。

n  霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约3-10um)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。

?          酵母一般：呈球形、椭圆形。（1~5）um × （5~30）um，（比细菌粗10倍左右），   发酵工业用酵母平均直径4~6 um。

4、繁殖方式

n  酵母菌：芽殖，或芽连成假丝

n  放线菌：孢子在气生菌丝未端形成直形、波形、簇生型或轮生型孢子丝

n  霉菌：无性繁殖时菌丝分化成与菌丝形态显著差异的繁殖菌丝如分生孢子、孢子囊孢子

五、实验报告

1、描述你所观察到的二种霉菌的菌落特征。

2、绘图：曲霉、青霉的个体形态图。

3、填写用血球计数板计数的结果。

4、填写真菌菌丝测微结果。

5、如何区别细菌、放线菌、酵母和霉菌？

第二篇：实验六 放线菌、霉菌形态观察

实验六  放线菌、霉菌形态观察

一、 实验目的

?          学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法。

?          初步了解放线菌和四类常见霉菌的基本形态特征。

二、基本原理

放线菌（原核微生物）：
   由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基以上的气生菌丝。有些气生菌丝分化成孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆状。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。

培养和观察方法

扦片法：在放线菌平板上扦上盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时直接取出盖玻片置于载玻片上镜检。

镜检：用镊子拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面朝上置于载玻片上，直接镜检。

宜用略暗光线观察，低倍镜—高倍镜；染色后观察效果更好。

玻璃纸法：将玻璃纸覆盖在平板表面，接种放线菌、培养，放线菌在玻璃纸上形成菌苔。观察时取下玻璃纸固定在载玻片上镜检。 镜检：先在载玻片上滴一小滴水，取下玻璃纸，使菌面朝上，使玻璃纸平贴于载玻片上。

优点：可观察到放线菌自然生长状态下的特征，和不同生长期的形态。

注意:整过程勿触动菌面培养物。

印片法：将要观察的放线菌的菌落或菌苔直接印在载玻片上，经染色后观察。

?    用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基一起切下，菌面朝上。另取一载玻片，微热后，轻轻按压菌苔，固定，染色后镜检。

?    主要用于观察孢子丝的形态，孢子的排列及其形状等，但形态特征可能有所改变。

霉菌（真核微生物）：
    霉菌是一类可产生复什分枝的菌丝体的真核微生物的统称。分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比放线菌粗的多。

培养和观察方法

载玻片法：将培养基薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在其间的有限空间内沿盖玻片横向生长。观察时直接将载玻片镜检。

玻璃纸法：与放线菌相似。

直接制片观察法：用解剖针挑取少量培养物置于预先滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。

?    50％乙醇用于洗去孢子；尽可能保持霉菌生长状态；避免产生气泡。

?    特点：细胞不变形；不易干燥，易保存；防止孢子飞散；增强反差。

三、实验器材

1、菌种  放线菌划线平板28℃,7天后培养物，曲霉、根霉、青霉和毛霉划线平板28℃,4天后培养物。

2、仪器  显微镜；

3、其他材料  平皿，载玻片，解剖针，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

四、操作步骤

观察放线菌气生菌丝和基内菌丝的区别

取插片一片，直接在显微镜下进行观察，注意分界面两侧菌丝形态的差异

观察黑根霉菌丝情况和子囊孢子情况（着重辨认孢子囊、包囊梗、假根）：

观察毛霉菌丝和分生孢子着生情况：

观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（着重辨认分生孢子梗、足细胞和分生孢子）：

分生孢子梗顶端膨大成圆形或椭圆形的顶囊，由顶囊向外辐射长出一层或两层小梗，最上层小梗呈瓶状，在其顶端生成成串的分生孢子。

观察青霉菌丝和分生孢子着生情况：

五、实验报告

?          记录所观察到的放线菌基内菌丝和气生菌丝的差别

?          绘图表示曲霉、根霉、青霉和毛霉的形态特征

?          思考题：

（1）镜检时，如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？

（2）你注意根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？