目的基因与载体连接、感受态制备及转化

【实验原理】

1；酶促生物化学反应过程

    在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。

2；DNA连接酶的分类：

   T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接

   大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子

3；T4 DNA连接酶：来源  T4噬菌体感染的大肠杆菌

   最佳pH值  7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液

   需ATP，Mg2+参加反应

   二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接

   作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。

4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。

5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统

   真核细胞：主要用于外源基因的表达

6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。

   转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。

7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。

常用方法：0.1mol/L CaCl2

特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷

      b.不存在载体的筛选标记

      c.接受DNA的位点暴露

      d.细胞膜通透性增加

8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。

直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段

    1.抗性筛选（抗生素平板，ampR , tetR , neoR）

    2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选)

    3.PCR

    4.限制性内切酶消化

    4.DNA测序

间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选

9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后， 有重组质粒的细菌形成白色菌落。

【实验数据】

上图即为蓝白斑筛选的结果，其中白斑即为重组体，蓝斑为未重组质粒的菌。

【实验分析】

1；若菌落不明显，原因是保温箱温度过高，培养基蒸干。

2；实验要注意无菌操作，所有步骤应在无菌区进行。

3；蓝色菌落较少，白色菌落多且明显是因为DNA连接的比较成功。

4；菌液涂抹均匀，菌落分布均匀。

5；未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

第二篇：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告

1 引言

在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主^[1]。感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法

2.1 实验原理

质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl₂ 处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。

pMD18-T载体是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加 "T" 而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

该载体携带有抗氨苄青霉素基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性，同时还能进行蓝白斑筛选，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。图1为pMD18-T载体的克隆位点图^[2]。

 

2.2 实验材料

2.2.1 仪器

所用仪器有超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴器、制冰机等。

2.2.2 器皿

所用器皿有移液枪（2.5ul、10ul、1000ul）、枪头盒（蓝、黄）、枪头（蓝、黄）、培养皿、1.5ml离心管、泡沫塑料盒、带帽试管、250ml锥形瓶、酒精灯、浮子等。

2.2.3 试剂

所用试剂有0.1mol/L CaCl₂溶液，购买的感受态细胞，LB液体培养基，LB固体培养基，氨苄青霉素（Amp），X-gal，IPTG等。

2.3 实验方法

从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于50ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（16小时）。分别取2.0ml菌液转接到三个含有100ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h。(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ ml,此为实验成功的关键)。将菌液转移到1.5 ml离心管中,冰上放置30min。在低温离心机中于4℃离心10min(4000rpm),回收细胞。倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽。用冰冷的0.1mol/L CaCl₂700μl悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。4℃ 4000rpm，离心10min，回收细胞。用冰冷的0.1mol/L CaCl₂300μl悬浮细胞 （务必放冰上）。取200μl新鲜配制的感受态细胞和20μl已购买的感受态细胞，分别加入DNA 2μl（50ng）混匀，冰上放置30min。将管放到42℃恒温水浴1-2min（约90秒）。冰浴2min。每管加800μl LB液体培养基，置于恒温摇床于37℃培养1h(慢摇)。100 ml的琼脂培养基中，灭菌后冷却到60度左右，加入100 μl的IPTG溶液、200 μl的X-Gal和100 μl的Amp，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。将适当体积已转化的感受态细胞，涂在含有X-gal 、IPTG及氨苄青霉素的LB固体培养基上。倒置平皿37℃培养12-16h，则出现菌落，观察并记录结果。

3 结果

两只培养皿经一天培养后，观察得到以下实验结果：自己配制的感受态细胞与质粒结合后经含有X-gal 、IPTG及氨苄青霉素的LB培养基培养24h，长出6个白色菌落，无蓝色菌落生长；购买的感受态细胞与质粒结合后经培养24h，长出8个白色菌落，无蓝色菌落生长。两板培养皿长出的菌落直径约1mm，呈白色，不透明，菌落突起，表面光滑湿润，边缘整齐。纵观两个平板上的菌落分布，都很均匀。

4 讨论

4.1 对实验结果的分析及结论

根据实验原理中阐述的蓝白菌落的形成原因，两个平板都只长出白色菌落而未长出蓝色菌落的结果表明：转化进大肠杆菌细胞内的质粒都是连接成功的质粒，也可以进一步说明连接那一步做得很成功。

自制的感受态细胞所得的那一板与购买的感受态细胞所得的那一板相比，菌落数较少。说明自制的感受态细胞有可能没有完全达到理想的感受态，导致进入的质粒偏少。两板平皿所得菌落分别是6、8，有些偏少，说明在转化的时候可能没有控制好条件致使有些质粒没有进入感受态细胞。

两板平皿菌落分布均匀说明菌液涂布得很均匀。

4.2 感受态细胞制备及转化中的影响因素

4.2.1 细胞的生长状态和密度

最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×10⁷个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。

4.2.2 质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来说，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍。

4.2.3 试剂的质量

化合物及无机离子的影响：所用的CaCl₂等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca²⁺的基础上联合其他二价金属离子（如Mn²⁺或Co²⁺）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。

4.2.4 防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的制剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

4.3 大肠杆菌感受态细胞其他的制备方法

除了本次实验用的氯化钙法之外，实验室常用的制备大肠杆菌感受态细胞的其他方法还有以下几种：

4.3.1 Glycerin-PEG（甘油-聚乙二醇法）

常规氯化钙法制备的感受态细胞维持其感受态时间往往较短，而甘油-聚乙二醇法较常规氯化钙法为优，转化结果显示：在-30℃条件下其感受态维持时间至少在180d以上。这可能与该细胞储存液中含有一定浓度的甘油和葡萄糖等保护剂有关。一般认为能保留少量水分的结晶化合物与一种胶态物质结合作为保护剂对菌体细胞长期储存的存活是必要的。此外，由于保护剂对菌体细胞和水均有很强的亲和力，故在复苏过程中它可代替结合水而稳定细胞构型。储存液中含有一定浓度镁离子和葡萄糖可以增强转化。此外，聚乙二醇为多糖类物质，这里可能有促使质粒DNA与感受态细胞膜结合的作用，与镁离子及葡萄糖共同促进质粒转化。

4.3.2 氯化铷法

氯化铷法也是实验室常用的一种感受态细胞制备方法，可用于不同的质粒的转化。此种方法对于同一种质粒，不同的菌种和冻存时间对转化效率无影响，其转化效率要高于氯化钙法，是一种可以长期保存而不影响转化效率的感受态细胞制备方法。

4.3.3 一步制备法

此种方法的特点是只加一种试剂即可，且不需要另加保护剂就可直接冻存，转化时不需要热激。但一步法对实验操作要求较高，如所用器具一定要清洁，OD600值不要高于0.6，制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作等。其转化效率相对较低，适用于对转化率要求不高的实验^[3]。

4.4 注意事项

实验中凡涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作，均应在无菌超净台中进行，以防污染。

衡量受体菌生长情况的OD600值和细胞数之间的关系随菌株的不同而不同，因此，不同菌株的合适OD600值是不同的。

悬浮菌体时不要剧烈推打枪头，要轻轻的悬浮菌体。

5 参考文献

[1]李芳,墙克信,王玉炯.大肠杆菌感受态细胞制备方法及应用的研究进展[J].宁夏医学院学报,2003,25(5):372-374.

[2]分子生物学实验指导.大肠杆菌感受态细胞的制备.

[3]房功思.浅谈大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法[J].安徽卫生职业技术学院学报,2008,7(2):96-97.